碳点荧光传感器检测茶叶中咖啡因的应用研究

2021-08-03蔡伟雅卢维玉于毅鹏

昆明学院学报 2021年3期

蔡伟雅，卢维玉，陈晓，黄燕，于毅鹏

(厦门理工学院材料科学与工程学院，福建厦门 361024)

碳点(Carbon Dots，CDs)是碳纳米家族的新成员，因其尺寸优势，该纳米材料具有较强的量子局限和边缘效应，以及类似于量子点和荧光染料的优良发光性质．CDs是Xu等[1]于2004年通过电泳的方法纯化单壁碳纳米管首次制得，其具备低毒性、良好的生物相容性，不仅可以用来代替传统的碳量子点和荧光染料，而且可用于细胞成像等方面．因为碳点具有优异的化学惰性、易官能团化以及上述优点，所以其已成为燃料电池催化剂[2]、金属离子传感器[3]、阴离子传感[4]、生物分析检测[5]、生物成像[6]、光催化[7-8]等领域的研究热点．因此，作为一种新兴的纳米材料，碳点具有广阔的应用前景．

荧光分析法是用所测得的荧光强度来测定实验样品荧光物质的含量，而荧光强度不仅与荧光物质的本性与溶度有关，还与激发波长和荧光仪器的检测器灵敏度有关．加大激发强度，可以增强荧光强度，从而提高分析的灵敏度[9]．荧光分析法的灵敏度相较于一般分析法高出2～3个数量级，具有很强的选择性．

本文主要讨论了碳点和吖啶橙之间发生荧光共振能量转移的条件．以吖啶橙为荧光传感器，检测咖啡因，寻找碳点和吖啶橙之间的最佳比例．此外，所采用的荧光分析法检测吖啶橙是基于荧光共振转移原理．而荧光共振能量转移是指化合物分子受到光激发后，分子内部发生能量供体与能量受体之间的一种非辐射过程的能量转移．

1 材料和方法

1.1 仪器与试剂

AB104-N电子天平(Mettler Toledo)；酸度计(美国Origin公司)；Milli-Q超纯水系统(美国Millipore公司)；KQ-300DB数控超声波清洗器(祁山市超声仪器有限公司)；RCT Basic恒温磁力搅拌器(德国Zeiss公司)；FLS 920稳态/瞬态荧光光谱仪(英国Edinburgh Instruments公司)；UV-2600紫外-可见分光光度计(日本Shimadzu公司)；F-3000荧光分光光度计(日本Hitachi公司)．

柠檬酸铵、高锰酸钾、咖啡因、无水乙醇、丙酮、氯化钠、盐酸(国药集团上海化学试剂公司)；吖啶橙(又称为3，6-(二甲氨基)吖啶盐酸盐)(上海生工生物工程有限公司)．

1.2 碳点材料的合成

碳点制备参照文献[10]的方法．将2 g柠檬酸铵溶于25 mL二次水中，等到柠檬酸铵固体全部溶解之后，将溶液转移至50 mL聚四氟乙烯反应釜内衬中．随后将反应釜内衬放入不锈钢反应釜外衬中，并转移至烘箱．烘箱温度设置为160 ℃，时间为6 h．待反应结束后，自然冷却至室温．当取出反应液时，溶液呈现深蓝色，如图1所示．

图1 水热法合成碳点样品的流程

1.3 CDs-AO荧光探针的制备

将CDs溶液与吖啶橙溶液(Acridine orange，AO)按照一定比例混合，利用磁力搅拌器混合搅拌2.5 h，即可获得CDs-AO荧光探针．

1.4 检测咖啡因

取10 mL比色皿，加入4 mL的中性PBS缓冲液(pH=7)，再加入一定比率的碳点和吖啶橙，最后在比色皿中滴加一定浓度的咖啡因，用二次水定容至10 mL，摇匀静置一段时间，测定荧光强度ICDs与IAO．

2 结果与讨论

2.1 碳点的物理表征

为了证明碳点的成功制备，对所合成碳点的形貌进行TEM表征，如图2(a)所示．碳点溶液在室温条件下，长期稳定，没有任何明显的沉降．碳点样品的透射电镜图显示出较为均一的球形颗粒，碳点的粒径集中分布在3.07 nm+0.55 nm范围内．与石墨烯不同的是，这些荧光碳点粒子可以自由分散在水中，实验过程中没必要再次超声分散，因此，其被称为“水溶性荧光碳点”．

图2(b)为碳点X射线衍射表征结果，从图2(b)可以看出，所测得的碳面晶间距为0.33 nm(或根据布拉格公式计算)，与石墨相(002)相似．由此可以断定，所制备的荧光碳点颗粒是石墨相的碳纳米颗粒．

图2 (a)碳点的透射电镜图像，(b)碳点的X射线衍射图

2.2 抗盐性考察实验

将一定量的碳点储备液分配在8支比色管中，分别加入不同体积的NaCl溶液，定容至5 mL，使得其中的NaCl溶液的浓度分别为0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0，1.5，2.0 mol/L，将配置好的溶液摇匀静置30 min后测定其荧光光谱．由图3可见，碳点的荧光强度性质基本保持稳定．

图3 碳点在不同浓度NaCl溶液中的荧光强度

2.3 抗光漂白性考察实验

将制备好的碳点水溶液放在365 nm紫外灯下照射，每间隔一段时间就表征样品的荧光性质，实验结果如图4所示．在120 min内，碳点的荧光强度基本保持不变，说明所合成的CDs很稳定，几乎没有光漂白现象．

图4 CDs荧光强度随紫外光照时间变化曲线

2.4 碳点与吖啶橙之间的荧光共振能量转移

图5为碳点和发射光谱与吖啶橙的吸收光谱．从图5看出，二者的重叠性很大．碳点在438 nm的位置具有较大发射信号峰，吖啶橙在490 nm具有最大吸收峰，存在很大一部分重叠．

图5 吖啶橙的吸收光谱与CDs的发射光谱

2.5 酸碱度对检测体系的影响

CDs-AO荧光探针与一定浓度的咖啡因在不同的酸碱条件下会有不同的响应效果，实验结果如图6所示．在中性条件(pH=7)下，碳点和吖啶橙的荧光强度比值最大，说明咖啡因对检测体系的荧光增强效果最好．因此，在后续研究过程中，均选用中性条件进行研究．

首先，选取吖啶橙浓度为1.0×10-4mol/L，加入不同浓度的碳点溶液，表征碳点与吖啶橙的荧光强度变化情况，实验结果如图7(a)所示．由图7(a)可知，加入碳点后，碳点与吖啶橙的荧光强度变化依次增强．其次，确定碳点浓度为4.22×10-5mol/L，加入不同浓度的吖啶橙溶液，检测吖啶橙溶液为单一变量的情况下的碳点与吖啶橙的荧光强度变化情况，实验结果如图7(b)所示．碳点的荧光信号峰在吖啶橙加入后逐渐减弱，而吖啶橙的荧光强度是先增强，当吖啶橙浓度超过160 μmol/L时，吖啶橙的荧光强度变弱．综合以上实验结果说明，选择合适的比率，碳点与吖啶橙之间会发生能量转移．

以上实验证明，控制CDs与AO的浓度比可以得到一系列不同的荧光强度比值．在之后的研究工作中，为了使体系中AO荧光增强效果明显，选取4.2×10-5mol/L的CDs和8.0×10-4mol/L的AO混合制备的用于检测咖啡因的荧光比率探针．

图7 (a)AO在不同浓度CDs下的荧光强度与浓度的关系趋势图，(b)CDs在不同浓度AO下的荧光强度与浓度的关系趋势图

2.6 CDs-AO荧光比率探针对咖啡因的传感

在上述实验条件下，进一步研究了CDs-AO比率荧光探针检测咖啡因的线性范围和检测限．从8(a)可知，加入不同浓度的咖啡因，CDs和AO的荧光光谱，随着咖啡因浓度增大，CDs荧光强度基本不变，而AO荧光强度逐渐增强．此外，由图8(b)可以看出，ICDs/IAO与咖啡因具有良好的线性关系，本方法的线性回归方程为ICDs/IAO=0.001 0×C+0.553 0，式子中C的单位是μmol/L，检测范围6.0×10-6～8.0×10-4mol/L，检测限为4.4×10-7mol/L (3SD/K)．

2.7 选择性表征(共存物质干扰)

在茶叶或者茶类饮料中，常见的主要成分有茶多酚、氨基酸、矿物质以及咖啡因．在研究过程中，选用L-茶氨酸、儿茶素、没食子酸以及常用的4种金属离子作为干扰物质(咖啡因浓度为10.0 μmol/L，L-茶氨酸、儿茶素、没食子酸的浓度为50.0 μmol/L，K+、Na+、Ca2+、Mg2+的浓度为100.0 μmol/L)，见图9．在这些干扰物质共存下检测咖啡因，经过测试，没有其他成分能够使得吖啶橙荧光显著增强．

图8 (a)含有不同浓度咖啡因溶液的荧光光谱图，(b)ICDs/IAO与咖啡因浓度的线性关系图

图9 在常见物质共存下CDs-AO探针的选择性

3 实际应用与机理探讨

为研究CDs-AO探针在实际生活中的应用，选取荷花茶作为研究对象(荷花茶样品如图10(a)所示)，称取2 g茶叶样品于烧杯中，加入80 ℃的开水后静置6 h，让茶水冷却至室温，过滤掉溶液中的茶叶．按照之前所设计的实验操作步骤检测茶叶样品中的咖啡因和金属阳离子．从10(b)可知，样品溶液中分别加入10.0 μmol/L咖啡因或者各类100.0 μmol/L的金属阳离子，对CDs-AO探针检测茶叶样品中的咖啡因的性能影响较小，从而验证了CDs-AO探针检测茶叶中的咖啡因具有较好的选择性和灵敏度．

AO溶液中的单体和二聚体之间存在化学平衡．然而，AO的单体有荧光峰，而AO的二聚体没有荧光．咖啡因单体能够与咖啡因形成π-π复合物(如图11)，促使化学平衡向吖啶橙单体方向移动，体系荧光逐渐增强．

此外，AO的单体和二聚体都有紫外吸收信号．AO单体的紫外吸收在490 nm，而AO二聚体的吸收在467 nm．当体系中不存在咖啡因或者咖啡因含量较少时，AO的吸收有两个明显的紫外吸收峰．当增加咖啡因含量时，AO单体峰逐渐增强，二聚体峰逐渐减弱，说明此时在溶液中发生了二聚体向单体的化学平衡移动．

4 结论

以CDs为能量供体，AO为能量受体，基于荧光共振能量转移，构建比率荧光传感体系来检测咖啡因．将CDs-AO的比率传感体系用于检测咖啡因，检测范围为6.0×10-6～8.0×10-4mol/L，检测限为4.4×10-7mol/L，表明本方法能够实现对咖啡因的快速检测．此外，CDs-AO双荧光比率传感体系检测咖啡因可以提高检测的准确度．