郝 毅

(吉林大学基础医学院，吉林 长春130021)

三阴性乳腺癌(TNBC)缺乏雌激素受体(ER)、孕酮受体(PR)和人表皮生长因子受体2(HER-2)，占所有乳腺癌的15%左右。与其他亚型乳腺癌相比，TNBC患者的总体生存率降低，恶性程度高，侵袭能力强，早期复发率高[1-2]。此外，程序性死亡配体1(PD-L1)在TNBC标本中被发现过度表达，并且与高度恶性和不良的临床预后相关[3]。在TNBC细胞表面高表达PD-L1抑制T细胞增殖，促进T细胞凋亡，形成免疫抑制微环境[4-5]。已有临床试验使用单克隆抗体，如Pembrolizumab或Atezolizumab来阻断PD-L1与其配体程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)信号，并揭示了其在三阴乳腺癌治疗中的有效性[6-8]。这些研究证实PD-L1可以作为TNBC的免疫治疗靶点[9]。然而，PD-L1在TNBC中的表达调控机制尚未完全阐明。

Tetraspanin 8(TSPAN8) 属于tetraspanin蛋白家族，在哺乳动物中该家族由33个成员组成的膜糖蛋白[10]。TSPAN8在包括卵巢癌和胃癌、肝癌、胰腺癌和胶质瘤的多种肿瘤中高表达，促进肿瘤细胞迁移、侵袭和转移，与患者预后成负相关[11-13]。在乳腺癌中，TSPAN8高表达于大多数原发灶及乳腺癌的脑、骨、肺和肝等转移灶中。在乳腺癌中，TSPAN8通过增强细胞-细胞粘附、增殖、间充质-上皮转化、抗辐射和胞外囊泡释放、增加乳腺癌细胞干性促进乳腺癌发展[14-15]。然而TSPAN8如何调控抗肿瘤免疫反应的机制尚不明确。因此本研究旨在探讨TSPAN8在TNBC免疫反应调节中的作用，为全面了解TSPAN8在乳腺癌发展中的作用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 细胞与试剂

人三阴乳腺癌细胞MDA-MB-231购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心，L-15培养基及胎牛血清购至Hyclone公司。TSPAN8抗体购于Abcam公司。PD-L1-PE流式抗体及其同型对照抗IgGk1-PE购于BD公司。

1.2 细胞转染

TSPAN8的小干扰siRNA-TSPAN8及空白对照病毒由上海吉凯公司构建。将MDA-MB-231细胞调整为1×105/ml，置于6孔板中培养过夜。次日向培养基中添加感染增敏剂Hi trans G P及siR-TSPAN8或空白对照病毒。感染12 h后换液，得到稳定表达的细胞株。

1.3 qRT-PCR法检测TSPAN8基因表达

将感染空白对照或si-TSPAN8病毒的MDA-MB 231细胞使用TRIzol法提取mRNA，并将其反转录成cDNA。使用SYBER Premix EaqTMII试剂盒进行实时定量检测。引物序列为：TSPAN8(forward):ACTTCTTGTTCTGGCTATGTGG, TSPAN8(reverse):CACAGCAACGTAGGAGCTAGA;GAPDH(forward):GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT,GAPDH(reverse):GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.4 Western blotting法检测蛋白表达

将感染空白对照或si-TSPAN8病毒的MDA-MB-231细胞使用RIPA法提取蛋白后，使用BCA蛋白定量检测试剂盒对其蛋白浓度进行定量。每孔蛋白上样量为30 μg，使用12%的分离胶进行蛋白电泳。结束后将蛋白转膜至PVDF膜。用脱脂奶粉室温封闭2 h后，4℃孵育TSPAN8及GAPDH的一抗过夜。次日用TBST清洗后加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗，室温孵育1 h。使用化学发光法对蛋白表达进行检测。

1.5 CCK-8法检测对细胞的杀伤作用

收集健康志愿者外周血5 ml，使用淋巴细胞分离液分离出PBMC。收集处于MDA-MB-231细胞，将其细胞数调整为1×105/孔，置于96孔板37℃培养。6 h后分别加入E/T为1∶4,1∶8,1∶16的PBMC进行共培养。不与PBMC共培养的MDA-MB-231细胞孔作为对照孔。使用CCK-8检测试剂盒检测共培养后24 h、48 h、72 h的杀伤效果。每孔设3组平行孔，实验重复3次。

1.6 流式细胞术

收集共培养后的细胞，调整细胞数为5×105/管，向其加入CD3、CD4、CD8、CD56抗体，室温孵育30 min后，对T细胞、NK细胞、NKT细胞所占比例进行检测。收集5×105个MDA-MB 231细胞，加入PD-L1抗体，室温孵育30 min后使用流式细胞仪检测肿瘤细胞表面PD-L1表达。

1.7 统计分析

2 结果

2.1 通过CCLE数据对比乳腺癌细胞系TSPAN8表达

为选取合适的人三阴乳腺癌细胞株作为研究对象，首先通过CCLE数据库对比人乳腺癌细胞系TSPAN8表达，如图1所示，多种人乳腺癌细胞系高表达TSPAN8，为探讨TSPAN8在三阴乳腺癌中对抗肿瘤免疫的调控作用，选取人三阴乳腺癌细胞系MDA-MB 231细胞用做后续敲除实验。

图1 通过CCLE数据库对比人乳腺癌细胞株TSPAN8的表达水平

2.2 siR-TSPAN8下调MDA-MB 231细胞TSPAN8表达水平

为探讨TSPAN8调控乳腺癌抗肿瘤免疫反应的机制，构建siR-TSPAN8及空白对照病毒感染MDA-MB-231细胞，利用qRT-PCR及Western blot方法比较感染对照组(siR-CTRL)或siR-TSPAN8细胞TSPAN8的表达水平。如图2(A,B)所示，与siR-CTRL相比，siR-TSPAN8组细胞TSPAN8的mRNA及蛋白水平均下调，差异具有统计学意义(P<0.01)。

图2 siR-TSPAN8下调MDA-MB 231细胞TSPAN8表达水平

2.3 下调TSPAN8增加免疫细胞杀伤MDA-MB-231细胞能力

为了研究TSPAN8的表达是否抑制免疫细胞的细胞毒活性，将感染对照组或者siR-TSPAN8的MDA-MB-231细胞以不同效靶比(1∶4,1∶8,1∶16)与PBMC共培养，用CCK8法检测细胞杀伤水平。以未与PBMC共培养的肿瘤细胞作为对照，将其细胞活性设为100%。如图3所示，PBMC对肿瘤细胞增殖具有剂量和时间依赖性的抑制作用。与siR-CTRL细胞组相比，siR-TSPAN8组的细胞活力在效靶比为1∶4,1∶8,1∶16时细胞活性均明显下降(P<0.01)。结果表明下调TSPAN8的MDA-MB-231细胞增强免疫细胞对其的杀伤活性。

图3 下调TSPAN8增加免疫细胞杀伤MDA-MB-231细胞能力(**P<0.01)

2.4 下调TSPAN8增加CD8+T细胞比例

为了研究TSPAN8表达主要影响的效应细胞，利用流式细胞分析仪分析了共培养前后T细胞、NK细胞和NKT细胞的比例。结果如图4所示，与对照组相比，敲除MDA-MB-231细胞中TSPAN8的表达，显著增加CD3+T细胞和CD8+T(CD3+CD8+)细胞的比例，而CD4+T细胞(CD3+CD4+)、NK细胞(CD3+CD56-)和NKT细胞(CD3+CD56+)的频率略有下降(P<0.01)。以上结果表明，下调TSPAN8增加CD8+T细胞比例，提示CD8+T细胞可能为TSPAN8主要影响的效应细胞。

图4 下调TSPAN8增加CD8+ T细胞比例(**P<0.01)

2.5 下调TSPAN8降低肿瘤细胞表面PD-L1表达水平

利用流式细胞分析仪对比对照组与siR-TSPAN8组细胞表面PD-L1的表达水平。使用同型对照染色作为染色对照，PD-L1表达用Δ平均荧光强度(ΔMFI)表示。如图5所示，与siR-CTRL相比，siR-TSPAN8细胞表面的PD-L1表达水平明显下降，结果有统计学差异(**P<0.01)。以上结果表明，下调TSPAN8降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平。

图5 下调TSPAN8降低肿瘤细胞表面PD-L1表达水平

3 讨论

由于缺乏有效的治疗靶点，手术和化疗作为TNBC的标准治疗。PD-L1广泛表达于多种肿瘤细胞、免疫细胞和上皮细胞中，与肿瘤免疫逃逸密切相关。与其他乳腺癌亚型相比，TNBC高度表达PD-L1，与肿瘤的发生发展和不良预后成正有关[15]。以PD-L1/PD-1为靶点的免疫治疗逐渐是TNBC的治疗选择，PD-L1在TNBC中的调节机制也成为近年来的研究热点。

越来越多的研究指出癌基因参与调节抗肿瘤免疫反应，这同时是癌基因促进肿瘤发生的另一种机制[16]。癌基因通过调节免疫检查点的表达来抑制抗肿瘤免疫应答。例如，MYC通过直接结合其启动子来增强PD-L1和CD47的表达，MYC的失活促进TNBC的抗肿瘤免疫反应[17]。也有研究发现其他癌基因，如粘蛋白1(MUC1)和表皮生长因子受体(EGFR)可以诱导PD-L1的表达[18-19]。

TSPAN8高表达于包括乳腺癌在内的多种肿瘤。其表达与多种肿瘤的生长及侵袭转移相关。然而TSPAN8调节抗肿瘤免疫反应的作用机制尚不明确。本研究证实多种乳腺癌细胞系高表达TSPAN8。与PBMC共培养实验结果表明，下调TSPAN8增加免疫细胞对TNBC细胞的杀伤水平。流式细胞仪检测结果表明，下调TSPAN8主要影响CD8+T细胞的比例，并且下调TSPAN8降低肿瘤细胞表面PD-L1的表达水平。以上结果表明，三阴乳腺癌通过高表达TSPAN8诱导PD-L1表达介导的免疫抑制。关于TSPAN8在乳腺癌细胞中调节PD-L1表达的可能机制尚不明确，本团队将在后续研究中进一步深入探讨。