李倩倩,陈沉,刘晓涵,慈一帆,宋扬

(青岛大学公共卫生学院,山东 青岛 266073)

结直肠癌(CRC)是世界上第三大常见的癌症,也是导致癌症死亡的常见原因之一[1]。只有10%的CRC病例具有遗传易感性,高达90%的病例无家族史或遗传易感性[2]。与CRC 发展有关的环境因素包括吸烟、酗酒、肥胖、久坐的生活方式、2型糖尿病、红肉的摄入、高脂肪饮食和纤维摄入量不足等。慢性炎症也是CRC 发生的重要环境危险因素之一[3]。有研究表明,一些促炎因子如干扰素-γ(IFN-γ)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)可以通过影响紧密连接(TJ)蛋白的表达,诱导肠道黏膜屏障功能受损[4-5]。而肠道黏膜屏障功能受损,如肠上皮细胞完整性破坏、肠黏膜通透性增加等与炎症相关[6]。肠道屏障功能受损和促炎因子共同作用,促进了CRC的发生发展[7]。纤维素是一种不可溶性膳食纤维,主要存在于蔬菜和水果等植物组织中[8]。有研究发现,补充纤维素可以减轻葡聚糖硫酸钠(DSS)诱导的小鼠炎症,抑制其肿瘤的发生[9-10]。MOEN 等[11]的研究结果也表明,纤维素能够降低氧化偶氮甲烷(AOM)诱导的A/J Min+小鼠的肿瘤负荷。纤维素具有抗炎和抗肿瘤作用,其可能的机制是改善了肠道屏障功能,但目前相关研究尚少。因此,本研究通过建立小鼠结直肠炎症肿瘤模型,探讨不同纤维素浓度膳食对结直肠肿瘤发生、炎症及肠道屏障功能的影响。现将结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 动物与试剂

SPF级C57BL/6小鼠100 只,雄性,6～8 周龄,体质量20～22 g,购自济南朋悦实验动物繁育有限公司(质量合格证号:37009200015329),饲养于清洁级动物饲养室。AOM 购自美国SIGMA 公司。DSS购自大连美仑生物技术有限公司。纤维素购自北京华迈科生物技术有限责任公司。小鼠饲料购自江苏南通特洛菲饲料科技有限公司,在标准AIN-93M 饲料的基础上,脱去或调整纤维素含量制成含0、25、50及100 g/L 纤维素的AIN-93M 饲料。本研究经青岛大学附属医院伦理委员会审批通过(伦审批件号:QYFYWZLL25668)。

1.2 研究方法

1.2.1动物模型制备 采用AOM/DSS建立结肠炎症肿瘤模型。第1天,小鼠腹腔注射浓度为1 g/L的AOM 10 mg/kg,7 d后,饮水给予20 g/L 的DSS,自由饮水7 d,间隔14 d,循环3个周期,完成模型制备。

1.2.2动物分组及其干预措施 将100 只雄性C57BL/6小鼠按体质量随机分为对照组(CG 组,标准AIN-93M 饲料喂养)、模型组(MG 组,不含纤维素的饲料喂养)、纤维素低剂量组(LCEG 组,含25 g/L纤维素饲料喂养),纤维素中剂量组(MCEG组,含50 g/L纤维素饲料喂养)和纤维素高剂量组(HCEG 组,含100 g/L 纤维素饲料喂养),每组20只。用标准AIN-93M 饲料适应性喂养1 周后,各组小鼠给予不同纤维素含量的AIN-93M 饲料,预防性饮食干预2周后,模型组及纤维素低、中、高剂量组小鼠建立AOM/DSS模型。实验期间,各组小鼠给予相应的AIN-93M 鼠粮干预,直至实验结束,实验持续13周。

1.2.3小鼠一般状态及肿瘤发生情况观察 每周记录小鼠体质量,每2 d记录小鼠进食进水量,观察各组小鼠精神、活动、毛色、饮食和排泄物等情况。于末次干预后24 h,眼球摘除取血;颈椎脱臼处死小鼠,剥离结直肠组织,剖开小鼠结直肠,记录肿瘤发生数(肿瘤最大直径≥2 mm),按下列公式计算抑瘤率。抑瘤率=(模型组肿瘤平均数量-纤维素干预组肿瘤平均数量)/模型组肿瘤平均数量×100%。

1.2.4小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin和闭锁带-1(ZO-1)m RNA 表达检测 采用实时定量PCR(RT-PCR)方法分别检测小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1m RNA 表达水平。用TRIzol试剂提取组织总RNA,用IMPLEN 纳米光度计、P-330 核酸检测仪测定m RNA 浓度和纯度。本研究中A260/A280比值范围为1.90～2.00,说明样品质量良好。使用Primer Script RT Reagent Kit和Bio-Rad My Cycler PCR 仪反向转录RNA(2μg)。PCR 引物序列见表1。PCR 通过Eppendorf Mastercycler EP梯度系统(Eppendorf)根据制造商说明进行操作。反应体积20μL,进行两步循环,包括95 ℃的变性步骤和60 ℃的退火/延伸联合步骤。GADPH作为内参基因。使用比较式2-△△ct计算基因表达的相对水平。实验重复3次,结果取均值。

表1 PCR 引物序列及大小

1.2.5小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达检测 采用Western blot法检测小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin和ZO-1蛋白表达水平。取50～100 mg肿瘤组织,用无菌手术剪将组织剪成细小的碎片,然后加入含磷酸酶抑制剂的RIPA 裂解液,提取肿瘤组织的总蛋白。用BCA 蛋白测定法测定蛋白浓度。测定完成后向各组蛋白中加入上样缓冲液,混匀,加热使蛋白变性。蛋白冷却后加入SDS-PAGE凝胶进行电泳分离,将分离后的蛋白分子转移至PVDF 膜上。再用含脱脂奶粉的TBST 封闭2 h,漂洗3次,加入一抗孵育3～4 h,漂洗后加入二抗孵育2 h。加入ECL 发光液在Fusion FX5 显影仪中显影,得到目的蛋白条带。以目的蛋白与内参蛋白灰度值的比值表示蛋白的相对表达量。实验重复3次,结果取均值。

1.2.6小鼠血清中TNF-α、白细胞介素-12(IL-12)和环氧化酶-2(COX-2)的检测 按照酶联免疫吸附试验(ELISA)试剂盒说明书操作,在酶标仪上读取450 nm 波长处各孔吸光度值,按稀释标准品制作的标准曲线计算出样本中细胞因子含量。

1.3 统计学分析

应用SPSS 17.0统计软件进行数据处理及统计学分析,计量资料以表示,多组比较采用单因素方差分析(ANOVA),组间两两比较采用LSD-t检验。P＜0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组小鼠一般状态及肿瘤发生情况

除CG 组外,在饮水中加入20 g/L的DSS期间及之后1周内,其他各组小鼠均出现毛色无光泽,呈静电样改变,活动减少,粪便性状改变,以及稀便、脱肛、血便等症状。但随着正常饮水,以上现象均会改善。CG、MG、LCEG、MCEG 和HCEG 组小鼠的存活率分别为100%(20/20)、55%(11/20)、75%(15/20)、85%(17/20)和90%(18/20)。实验结束之后解剖小鼠,观察并记录肿瘤的发生情况。LCEG、MCEG、HCEG 组小鼠结直肠肿瘤数量较MG 组减少,MCEG、HCEG 组较LCEG 组减少,HCEG 组较MCEG 组减少,差异均有显著意义(F=93.23,P＜0.05)。LCEG、MCEG 和HCEG 组的抑瘤率分别为47.06%、61.34%和73.95%。见表2。

表2 各组小鼠肿瘤发生情况的比较()

表2 各组小鼠肿瘤发生情况的比较()

与MG组相比较,a P ＜0.05;与LCEG 组比较,b P ＜0.05;与MCEG 组比较,c P＜0.05。

2.2 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1 m RNA表达比较

研究结果表明,MG 组小鼠结直肠肿瘤组织中的Claudin-1m RNA 表达水平较CG 组明显升高,而LCEG、MCEG、HCEG 组Claudin-1m RNA 表达水平较MG 组明显降低,差异有统计学意义(F=13.34,P＜0.05)。MG 组小鼠结直肠肿瘤组织中的Occludin、ZO-1m RNA 表达水平较CG 组明显降低,而MCEG、HCEG 组Occludin、ZO-1m RNA表达水平较MG 组明显升高,差异均有显著性(F=152.56、65.30,P＜0.05);MG 组和LCEG 组小鼠结直肠肿瘤组织中ZO-1、Occludinm RNA 表达水平差异无显著性(P＞0.05)。见表3。

表3 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表达影响()

表3 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1 mRNA表达影响()

与CG 组比较,a P＜0.05;与MG 组比较,b P＜0.05;与LCEG 组比较,c P＜0.05;与MCEG 组比较,d P＜0.05。

2.3 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达的比较

MG 组小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1蛋白表达水平较CG 组明显升高,LCEG、MCEG、HCEG组Claudin-1蛋白表达水平较MG 组明显降低,差异均有显著性(F=162.21,P＜0.05)。MG 组小鼠结直肠肿瘤组织中Occludin、ZO-1 蛋白表达水平较CG 组明显降低,LCEG、MCEG、HCEG 组Occludin 蛋白表达水平较MG 组明显升高,MCEG、HCEG 组ZO-1蛋白表达水平较MG 组明显升高,差异均有显著性(F=115.12、40.55,P＜0.05);而MG 组和LCEG 组小鼠结直肠肿瘤组织中ZO-1 蛋白表达水平差异无显著性(P＞0.05)。见图1、表4。

表4 各组小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达的比较()

表4 各组小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达的比较()

与CG 组比较,a P＜0.05;与MG 组比较,b P＜0.05;与LCEG 组比较,c P＜0.05;与MCEG 组比较,d P＜0.05。

图1 各组小鼠结直肠肿瘤组织Claudin-1、Occludin、ZO-1蛋白表达的Western blot检测

2.4 各组小鼠血清中炎症因子表达的比较

与CG 组相比,MG、LCEG、MCEG 和HCEG组小鼠血清中TNF-α、COX-2 的表达水平明显升高,IL-12的表达水平明显降低;与MG 组相比较,LCEG、MCEG 和HCEG组小鼠血清中TNF-α的表达水平明显降低,IL-12 的表达水平明显升高,MCEG 和HCEG 组小鼠血清中COX-2的表达水平明显降低(F=43.15～243.45,P＜0.05)。MG 组和LCEG 组小鼠血清中COX-2的表达水平差异无显著性(P＞0.05)。见表5。

表5 各组小鼠血清中相关炎症因子表达的比较(ρ/ng·L-1,)

表5 各组小鼠血清中相关炎症因子表达的比较(ρ/ng·L-1,)

与CG 组比较,a P＜0.05;与MG 组比较,b P＜0.05;与LCEG 组比较,c P＜0.05;与MCEG 组比较,d P＜0.05。

3 讨 论

研究表明,纤维素可以减轻肠道炎症和抑制肿瘤发生[8-9]。本研究通过AOM/DSS诱导成功建立小鼠结直肠炎症肿瘤模型,用含不同浓度纤维素的饲料进行干预,结果显示,与MG 组相比,纤维素干预能够使AOM/DSS诱导的CRC 小鼠的肿瘤数量降低,增加结直肠肿瘤的抑瘤率。另外,本研究还显示,纤维素干预能够影响小鼠结直肠肠道屏障功能。

TJ由跨膜蛋白(如Occludins、Claudins)和连接黏附分子以及外周膜蛋白(如zona occludens,ZO-1、-2、-3)等组成[10]。在健康状态下,TJ蛋白能够构建一种动态的肠道屏障,调节细胞间隙对水、营养物质和电解质的摄取。而TJ功能障碍可以破坏肠道屏障的完整性,促进肠道炎症以及结直肠肿瘤的发生[11]。Claudin-1能启动TJ结构的形成活性,其过度表达可导致肠上皮细胞分化,使肠黏膜受损[12]。Occludin在胞外环和跨膜区选择性调节细胞间隙的通透性[13]。ZO-1能够与Occludin相结合,调节细胞间隙通透性,在细胞间具有黏附作用[14]。下调ZO-1的表达,能够阻断和破坏TJ复合体的完整性,增加上皮通透性[15]。

慢性炎症和癌症之间的联系密切[2]。炎症性肠病(IBD)包括溃疡性结肠炎(UC)和克罗恩病(CD),该病病人患CRC 的风险显著增加[16]。有研究显示,与健康对照组相比,UC 病人结肠组织中Claudin-1蛋白表达上调[17]。PORITZ等[18]的研究结果也显示,UC病人结肠样本中Claudin-1蛋白的表达增加,Occludin 蛋白的表达减少。KUCHARZIK等[19]的研究则显示,UC 和CD 病人结直肠组织中的Occludin蛋白表达下调。SOLER 等[20]研究表明,在人类和大鼠中,肠肿瘤周围区域的TJ通透性增加;在人类肠道的肿瘤丰富区域TJ蛋白ZO-1和Occludin表达减少。纤维素能够改善肠道黏膜屏障功能,抑制肠道炎症及肿瘤的发生发展[8-9]。与上述研究结果一致,本研究结果也显示,AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1的表达水平明显升高,Occludin、ZO-1的表达水平明显降低;纤维素干预后,Claudin-1的表达水平明显降低,Occludin、ZO-1 的表达水平明显升高。表明AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠,其TJ功能受损,结直肠肠道屏障的完整性被破坏,而纤维素的干预使TJ功能得到一定程度的恢复,从而保护肠道屏障的完整性。

肠黏膜屏障功能受损可能与肠道炎症有关,因此本研究还检测了小鼠血清中的炎症相关指标。TNF-α可以通过增加肌球蛋白轻链激酶磷酸化影响TJ,降低上皮屏障功能[21]。本文研究结果显示,AOM/DSS诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠血清中TNF-α的表达水平明显升高,在纤维素干预后,小鼠血清中TNF-α的表达水平明显降低,肠道炎症改善。表明纤维素干预可能通过调控炎症因子TNFα表达,改善肠道屏障功能。IL-12在抗肿瘤免疫及抗感染免疫中起重要作用,与正常人相比,CRC 病人外周血中IL-12的表达水平明显降低[22]。本研究中,IL-12在结直肠炎症肿瘤模型小鼠血清中的表达水平明显降低,在纤维素干预各组中的表达水平明显升高。COX-2在炎症过程中是重要的限速酶,其高表达与慢性炎症和肿瘤的发生有关[23]。本研究结果显示,在结直肠炎症肿瘤模型小鼠血清中COX-2的表达水平明显升高,在纤维素干预组中其表达水平明显降低。可见,纤维素干预可使结直肠炎症肿瘤模型小鼠的肠道炎症减轻。

综上所述,纤维素干预能够减少AOM/DSS诱导的模型小鼠的肿瘤数;降低小鼠结直肠肿瘤组织中Claudin-1的表达,升高Occludin、ZO-1的表达,改善肠道屏障功能;降低小鼠血清中TNF-α、COX-2的表达水平,升高IL-12的表达水平,减轻肠道炎症。纤维素干预可能通过改善AOM/DSS 诱导的结直肠炎症肿瘤模型小鼠的肠道屏障功能,减轻其肠道炎症,而抑制结直肠肿瘤的发生。但相关机制还需进一步研究。