王晓艳

（山东省临沂市莒南县检验检测中心 山东临沂 276600）

1 概述

黄曲霉毒素主要是由黄曲霉和寄生曲霉等霉菌在一定的温度和湿度下产生的结构相似的代谢产物，黄曲霉菌广泛存在于自然环境中，高温、高湿是黄曲霉菌生长与繁殖的良好条件。

2 危害

黄曲霉毒素B1 是所有已知黄曲霉毒素中毒性最强的一种。据文献介绍，其毒效相当于氰化钾的10 倍，砒霜的68 倍，是迄今为止发现的致癌性最强的天然毒物，而且对大多数动物都有强烈的毒性作用，其危害主要表现在以下几个方面：

2.1 饲料适口性差

污染的饲料在霉变过程中，霉菌的生长消耗了饲料中的营养物质，并分解饲料中的蛋白质和糖化淀粉，使饲料颜色、气味、品质发生改变，从而影响了饲料的适口性，畜禽表现饿而不食，趋食槽而不亲料，有钩料、刨料、剩料现象，导致采食量降低，生长发育受阻。

2.2 动物繁殖性能降低

黄曲霉毒素能够破坏雄性畜禽睾丸功能，导致睾丸萎缩，曲精细管发育不良，妨碍精液产生，精液质量下降，受精率低，性欲降低或丧失。

母畜：出现流产、死胎、木乃伊胎、畸形胎以及产后不发情、假发情、迟发情等繁殖障碍,无乳、少乳、乳腺炎现象增多。

育肥猪、保育猪：表现体温升高，皮肤发红，食欲下降、外阴红肿，出现早发情、假发情现象。

母禽：表现卵巢发育不良或不发育，产蛋率下降，蛋品品质差。

2.3 引起机体免疫抑制

能够抑制核酸蛋白质的生物合成，阻碍生物转化、破坏吞噬细胞，损害免疫系统，抑制免疫应答，造成免疫失败，为其它疾病的继发感染埋下了隐患，所以霉菌毒素中毒被业内专家形象地称为“底色病”。

2.4 造成肝毒、肾毒、肺毒、肠毒症

黄曲霉毒素能够损伤肝脏，引起肝脏肿大硬化，降低肝脏的解毒消化机能；损伤肾脏，破坏肾脏的排毒排泄机能，造成机体代谢障碍；侵害肺脏，特别是年幼畜禽对黄曲霉菌毒素更加敏感，尤其是养殖环境中霉菌毒素超标，吸入后极易引发肺脏生成肿瘤、结节、霉斑，导致肺功能降低或丧失；引发肠炎，家禽表现排料粪、稀粪、鱼肠子粪、西红柿样粪，家畜表现消化不良，粪便稀薄，粪便黏稠，重者血便等症状。

3 检测

日常工作中，通常采用免疫亲和柱净化结合高效液相色谱法来检测饲料中黄曲霉毒素B1，该方法简便快速，灵敏准确，特异性高，实用性强。

这种分野在杜特尔特政权内部也现实存在。2017年3月，在中国海洋科考船过航“宾汉隆起”一事上，菲律宾防长表达了与总统杜特尔特不同的观点；[41]4月菲律宾代外长马纳洛也在采访中表达了与杜特尔特“疏美”立场相异的观点。[42]上述分歧既可能是菲国内亲美势力的反弹与施压，也可能源自于杜特尔特政权迫于国内政治压力的让步。

3.1 试验原理

样品经过甲醇水提取后，提取液经过滤、稀释后，使用免疫亲和柱层析净化，最后经高效液相色谱分离柱后光化学衍生荧光检测器检测，外标法定量。

3.2 所需试剂

甲醇（色谱纯），默克公司；乙腈（色谱纯），默克公司；氯化钠（分析纯）；黄曲霉毒素B1 标准品，Sigma 公司，黄曲霉毒素B1 原液浓度为20μg/mL，使用前逐步稀释成100ng/mL 浓度的工作液。

3.3 主要仪器设备

Agilent 1260 高效液相色谱仪带FLD 荧光检测器、光化学衍生器、高速混匀器、玻璃纤维滤纸、固相萃取装置带真空泵等。

3.4 样品制备

按照GB/T 14699.1—2005 采集样品，按照GB/T 20195—2006 用四分法缩减至500g，用粉碎机粉碎后过1mm 孔径的分析筛，混匀后作为待检样品。

3.5 黄曲霉毒素B1 毒素的提取与纯化

称取25g 待检样品加入5g 氯化钠与125mL 的甲醇水（70:30）溶液混匀，高速混匀20min，使用快速定性滤纸过滤收集滤液，取10mL 滤液加入20mL 的超纯水稀释，再用玻璃纤维滤纸过滤，收集滤液作为上样液备用。

取15mL 上样液过免疫亲和柱净化，调节固相萃取装置压力，使液体以1～2 滴/s 的速度流出。待柱内液体排干后，用10mL 超纯水洗涤柱子两次，流速为2～3 滴/s。待液体完全排干后，增大压力使免疫亲和柱完全抽干。上样1mL 的甲醇洗脱，为了能够更好的地洗脱毒素，加入甲醇之后最好孵育1min。流速为1 滴/s，收集洗脱液并定容至1mL。洗脱液使用0.22μm 的有机微孔过滤器过滤并转移至样品瓶中，供色谱分析用。

3.6 色谱条件

流动相：超纯水60+乙腈:甲醇（1:1）40 等度洗脱；

色谱柱：Agilent C18 柱（规格：150mm*4.6mm，填料粒径5μm）；

流速：1.0mL/min；柱温：40℃；进样量：50μL；波长：激发波长360nm，发射波长440nm。

3.7 高效液相色谱（HPLC）测定

3.7.1 标准工作曲线对0.10、0.50、2.0、5.0、10.0、20.0、40.0ng/mL 的系列标准溶液按以上色谱条件进行测定，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标，得到标准曲线回归方程（图1）。

图1 标准曲线线性图谱

3.7.2 测定图谱 标准样品（图2）、待检样品（图3）、加标样品（图4）色谱测定图谱如下。

图2 标准样品图谱

图3 待检样品图谱

图4 加标样品图谱

3.8 精密度与回收率试验

1）饲料样品中黄曲霉毒素B1 精密度试验（以2 份饲料为例）：按照上述试验方法处理2 份不同饲料样品，分别做5 个平行，然后分别上机进行色谱测定，其结果的标准偏差（RSD，%）分别为4.551%，2.918%。具体结果见表1。

表1 黄曲霉毒素B1测定的精密度

2）饲料样品中黄曲霉毒素B1 回收率试验：在2 份已知的空白饲料样品中，分别加入20ng/mL 浓度的黄曲霉毒素B1 标准溶液，同样按照上述试验方法处理加标样品，分别做5 个平行，然后分别上机测定，其结果的标准偏差（RSD，%）分别为4.373%、4.273%。测定平均回收率为95.268%、94.646%，具体结果见表2。

表2 黄曲霉毒素B1测定的回收率

3.9 线性范围与最小检测量

黄曲霉毒素B1 浓度在0.1～40ng/mL 范围内呈良好线性关系，相关系数为0.99999，该方法的检出限为0.1μ g/kg，残留标准误差为0.83937。

4 小结

“病从口入”。品质优良的饲料是畜牧业健康发展的基础，饲料质量的优劣不仅关系到动物安全和生产效益，而且直接影响人们的身体健康及公共环境安全。因此，在畜禽养殖生产过程中，广大从业人员一定要加强行业自律，严把饲料原料关，强化饲料生产、运输、储存等环节的监管、检测，防止饲料及原料污染、霉变，为社会输出优质、安全、绿色、无污染的畜禽及其产品，让人们吃的安心，用的放心。