周添， 刘菲

(水资源与环境工程北京市重点实验室， 中国地质大学(北京)， 北京 100083)

克百威是一种典型的氨基甲酸酯类农药，由美国 FMC公司在1967年首次合成，广泛适用于甘蔗、水稻、玉米、棉花等多种作物[1]。按中国农药毒性分级标准，克百威属于高毒农药[2]，被人体摄入后，通过改变膜的渗透性与流动性来破坏人体神经环境平衡，进而威胁生命[3]。3-羟基克百威是克百威的一种代谢产物，其毒性与母体相当。克百威及3-羟基克百威均具有高淋溶迁移性，容易通过地表径流方式进入水体，从而对水生生态环境和人类饮用水源构成潜在威胁[4]。因此，实现水体中克百威与3-羟基克百威的提取与检测对地下水管理具有非常重要的现实意义。

在农药残留分析过程中，样品前处理步骤所需时间通常占据了分析时间的61%，并对分析的可靠性和准确性起到了至关重要的作用，因此前处理步骤是分析检测的重要环节[5]。目前，国内外对于提取克百威与3-羟基克百威的前处理方法已开展了相关研究，最常用的方法是液液萃取法和固相萃取法。例如,Mudiam等[6]利用液液萃取方法提取蚯蚓代谢物中的克百威进行生态毒性评估；Simone等[7]利用液液萃取的方法提取水样中的克百威并使用高效液相色谱和紫外检测进行了分析；杨清华等[8]使用液液萃取与气相色谱-质谱(GC-MS)联合的方法同时测定了蔬菜中克百威、3-羟基克百威与丁硫克百威的残留；Otieno等[9]利用固相萃取的方法提取肯尼亚秃鹫体内的克百威和3-羟基克百威进行毒性评估；Ma等[10]建立了一种磁性固相萃取的前处理方法来提取水中的克百威和甲萘威；Zhang等[11]利用固相萃取与高效液相色谱联合的方法测定人体血清中的克百威；Zhang等[12]利用固相萃取与气相色谱联合的方法测定稻田生态系统中克百威及3-羟基克百威的残留。虽然这些技术应用时间长，方法相对较为完善，萃取效果也很可观，但是仍然存在一些不可忽视的缺点，如操作繁琐、萃取时间长，并且需要消耗大量的有毒有机溶剂，易对环境造成污染。将上述萃取技术微型化，建立不用或少用有毒有机溶剂、成本低、操作简单、应用范围广的样品前处理技术检测方法一直是研究者努力的方向[13]。

为实现地下水中克百威与3-羟基克百威的快速定量分析，本文建立了一种小体积液液萃取联合气相色谱-质谱的分析方法。通过对比不同萃取条件下两种物质的回收率，确定了最优前处理条件。该方法精密度和准确度良好，具有操作简单、耗时较短、溶剂使用量少的优点。

1 实验部分

1.1 仪器与主要试剂

气相色谱-质谱联用仪(GC-MS，Agilent 7890-5977，美国Agilent公司)；涡旋振荡器(美国Mobio公司)；pH计(北京旭日东辉公司)；进样针(规格为10、100、1000μL，汉密尔顿公司)；棕色试剂瓶(2mL，美国Agilent公司)；玻璃离心管(10mL)。

克百威标准样品(100μg/mL，农业部环境保护所)；3-羟基克百威标准样品(100μg/mL，农业部环境保护所)；苊-d10(2000μg/mL，美国O2SI公司)；2-氟联苯(1000μg/mL，美国O2SI公司)。

二氯甲烷、乙酸乙酯、环己烷、丙酮(农残级，迪马公司)；浓硫酸、氢氧化钠(分析纯，北京化学试剂厂)；氯化钠(分析纯，北京化学试剂厂)，置于400℃马弗炉内烘烤12h，干燥后备用；超纯水。

1.2 前处理方法

实验准备过程中，需要将足量的氯化钠放入马弗炉中，400℃高温烧制4h以上，放至常温备用。实验之前，所有的玻璃仪器要经50%硝酸浸泡，后经去离子水和酒精洗涤后，于105℃烘箱内烘干，备用。准确加入5mL水样于10mL玻璃离心管中，加入0.2g已烘干的氯化钠，摇匀并调节pH至5。然后准确加入10mg/L替代物2-氟联苯20μL，在涡旋振荡器上以1300r/min速度涡旋振荡3min。向水样中准确加入1mL二氯甲烷进行萃取，并在涡旋振荡器上以1300r/min的速度涡旋振荡3min，摇匀后，静置5min。向2mL试剂瓶中准确加入480μL二氯甲烷和20μL 20mg/L内标苊-d10，然后使用1000μL的微量进样器伸入到玻璃离心管底部准确提取500μL有机相转移至试剂瓶内，摇匀。最后，进行上机检测分析。

1.3 GC-MS分析条件

色谱条件：色谱柱选择为DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细柱，柱流速为1.0mL/min。进样口温度为250℃，采用不分流进样，进样量为1μL，载气为氦气(纯度为99.999%)。升温程序：初始温度为50℃，保持1min，以20℃/min升温至150℃，保持2min，后以15℃/min升温至250℃，保持6min，最后以300℃运行2min，总运行时间为23min。

质谱条件：离子源温度为230℃，四极杆温度为150℃，MS接口温度为280℃。离子源为EI源，信号采集方式为SIM和SCAN同时采集，溶剂延迟时间为5min。分析物目标离子质量数见表1。图1为4种待测物质分离的总离子流图，峰型尖锐，在11min内各组分可以得到很好的分离。

表1 分析物目标离子质量数

1—克百威； 2—2-氟联苯(SS)； 3—3-羟基克百威； 4—苊-d10(IS)。图1 分析物总离子流图Fig.1 Total ion current chromatograms of target compounds

1.4 标准曲线的绘制

用二氯甲烷配制浓度为100、200、300、400、500、600、700、800μg/L的克百威与3-羟基克百威标准溶液。按照1.3节的测试方法，使用内标法绘制标准曲线。测得克百威和3-羟基克百威的线性范围为100～800μg/L，两种物质的色谱峰峰面积和浓度线性相关，且线性相关系数(R2)均大于0.99。

2 结果与讨论

2.1 萃取溶剂的选择

选择合适的萃取剂是决定萃取效率的关键因素，需要考虑萃取剂的密度、挥发性、对目标物质的萃取能力以及萃取剂对后续色谱分离分析的影响[14]。因此，本研究依次选取了二氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯作为萃取剂处理样品，具体实验步骤参照1.2节。每种萃取剂做3组平行样品，分析结果见图2a。克百威以二氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯为萃取剂时，回收率分别达到83.4%、75.7%和78.0%；3-羟基克百威以二氯甲烷、环己烷、乙酸乙酯为萃取剂时，回收率分别达到41.3%、39.1%和40.1%。因此，当选择二氯甲烷作为萃取剂时，克百威及3-羟基克百威的回收率最高，萃取效果最好。原因是克百威、3-羟基克百威和二氯甲烷均为极性物质，而环己烷是非极性物质，根据相似相溶原理，克百威与3-羟基克百威更能溶于二氯甲烷[15]。乙酸乙酯较其他两种溶剂在水中的溶解度较大，故萃取效率不佳。因此，本研究选择二氯甲烷作为萃取剂。

a—萃取剂； b—pH值； c—氯化钠添加量。图2 不同萃取条件下克百威和3-羟基克百威的回收率对比图Fig.2 Recoveries of carbofuran and 3-hydroxycabofuran in different extraction conditions

2.2 溶液pH值的影响

由于农药自身的性质，溶液的pH值也会影响目标农药的萃取效率。本研究考察了溶液pH值分别为3、5、7、9时的萃取效率。萃取前先向水样中加入稀释后的硫酸，调至目标pH值。在萃取剂选用二氯甲烷的前提下按照1.2节步骤处理样品，每个pH水平做3组平行样品，结果见图2b。克百威在pH值为3、5、7、9的条件下，回收率分别达到61.7%、80.1%、66.9%和24.8%；3-羟基克百威在pH值为3、5、7、9的条件下，回收率分别达到32.5%、45.5%、37.5%和11.3%。不同pH值条件下回收率差异大的原因是由于克百威在中性和酸性条件下稳定，在碱性条件下易水解失效[16]。在其他条件相同的情况下，当溶液pH值为5时，克百威及3-羟基克百威的回收率最高，萃取效果最好。因此，本研究选择pH=5作为萃取的最佳pH值。

2.3 氯化钠用量的确定

在水样中加入氯化钠，可改变水溶液中的离子强度，产生一定的盐析效应，有利于萃取效率的提高[17]。参照2.1和2.2节结论，在萃取剂选用二氯甲烷，调节水样pH=5的条件下，按照1.2节步骤处理样品，分别用0.1、0.2、0.3、0.4g氯化钠进行盐析。每个氯化钠添加量做3组平行样品，结果见图2c。克百威在氯化钠添加量为0.1g、0.2g、0.3g、0.4g的条件下，回收率分别达到88.0%、98.6%、81.6%和75.1%；3-羟基克百威在氯化钠添加量为0.1g、0.2g、0.3g、0.4g的条件下，回收率分别达到55.0%、66.3%、61.7%和60.7%。结果表明，当氯化钠添加量为0.2g时，克百威及3-羟基克百威的回收率随着氯化钠添加量的增加而增加；继续增加氯化钠用量，回收率反而减小。因此氯化钠的最佳用量为0.2g，即40g/L。

2.4 分析方法评价

2.4.1仪器精密度

选用100、400和800μg/L的混合标准溶液各重复测定5次来衡量仪器的精密度。表2结果显示，克百威及3-羟基克百威测定的RSD均小于10%，表明仪器精密度良好。

表2 仪器精密度

2.4.2方法精密度

方法精密度主要是通过平行样品之间的相对标准偏差(RSD)来衡量的[18]。在5mL纯水中配制克百威与3-羟基克百威混合浓度分别为100μg/L和800μg/L的空白加标样品，每个浓度做5个重复样，按照优化的前处理方法制备样品。计算相对标准偏差(RSD)和回收率。表3结果显示，在两种不同浓度下，两种农药的RSD均小于10%，克百威回收率为71.1%～88.6%，3-羟基克百威回收率为41.3%～54.4%，可以认为该测试方法的精密度良好。由于3-羟基克百威在水中的溶解度为6207mg/L(20℃)，而克百威在水中的溶解度为700mg/L(25℃)[19]。因此，3-羟基克百威的极性远高于克百威，更易溶于水，不易被萃取出来，导致回收率相对较低。

表3 方法准确度

2.4.3方法检出限

在5mL纯水中配制克百威与3-羟基克百威浓度各为100μg/L的空白加标样品7个，按照前处理方法萃取后不连续进行7次测量，要求将这7个样品不连续地分布在72h内[20]。按公式(3)计算，进而得到物质的检出限(MDL)。

MDL=t(n-1,0.99)×s

(3)

式中：t(n-1,0.99)是置信度为99%、自由度为n-1时的双边分布t值，t(6,0.99)=3.143[21]；s为重复测量的标准偏差。

方法检出限结果显示(表4)，克百威的方法检出限为15.3μg/L，3-羟基克百威的方法检出限为10.2μg/L，满足加标浓度<10倍的MDL计算值。

表4 方法检出限

侯宪文等[22]建立了一种可以同时测定克百威和3-羟基克百威的高效液相色谱分析方法，选取了甲醇-水(体积比50∶50)为流动相，流速1.0mL/min，C18柱，紫外检测器波长269nm，进样体积10.0μL；测得克百威的检出限为18.2μg/L，3-羟基克百威的检出限为13.5μg/L，均高于本研究中两种物质的检出限。白雪媛[23]建立了一种可以同时检测地下水中82种农药的气相色谱-质谱分析法，选用DB-5MS(30m×0.25mm×0.25μm)毛细柱，进样体积1.0μL；测得克百威的检出限为86.1ng/L，3-羟基克百威的检出限为110.2ng/L，比本研究中两种物质的检出限低2～3个数量级，但仪器检测时间比本文测试方法长15min，相对而言本文方法更适用于室内快速检测。

3 结论

采用小体积液液萃取前处理及气相色谱-质谱分析法建立了实验室中快速检测地下水中克百威及3-羟基克百威的测定方法。在水样体积5mL、萃取剂体积1mL的条件下，最佳前处理条件为选择二氯甲烷作萃取剂、pH=5以及氯化钠添加量为0.2g。该方法的精密度良好，克百威和3-羟基克百威的方法检出限分别为15.3μg/L、10.2μg/L，能够满足室内模拟实验需求。

与传统液液萃取相比，该方法具有对环境污染小，且操作简单、快捷的优点，实际应用中还可通过调整萃取试剂和水样的体积比来满足不同情境下的测试需要。