袁 婷，秦利军，赵德刚，2

（1.贵州大学 生命科学学院/农业生物工程研究院，贵州 贵阳 550025；2.山地植物资源保护与种质创新省部共建教育部重点实验室，贵州 贵阳 550006）

杜仲Eucommia ulmoidesOliv.是我国特有的古生且分布较广的药用树种和重要的胶源树种，具有较高的经济价值，杜仲在我国的种植面积为天然橡胶树Hevea brasiliensis的数倍[1-3]。杜仲叶片、树皮和翅果中均含有一种特殊物质，外力作用下会出现一种白色丝状物，该物质即为杜仲胶（Eucommiarubber，EuR），不同组织中含胶量不同，叶片中含胶量为3%～5%，树皮中为6%～10%，而翅果中为12%～18%[4-7]。分子结构测定表明，杜仲胶为反式聚异戊二烯（trans-polyisoprene），与天然橡胶（Natural rubber，NR）（顺式聚异戊二烯，cis-polyisoprene）互为同分异构体[8]。两者结构的微观差异引起宏观性能的不同，杜仲胶属于硬橡胶（Hard rubber）具橡塑二重性，而天然橡胶属于软橡胶（Soft rubber）具高弹性[9-11]，与三叶橡胶树的天然橡胶相比，杜仲胶常温下结晶，具有耐疲劳性能、粘接性能、物理机械性能等优点[12]，杜仲胶的优良特性决定了其在绿色轮胎、医疗器械和海底电缆等领域的潜在应用前景[13-15]。尽管杜仲树皮中的杜仲胶含量仅次于杜仲翅果，但由于树皮采割量有限和新皮生长周期长等缺点，极大限制了杜仲皮作为杜仲胶规模化提取的原材料。与杜仲皮相比，杜仲翅果因收获周期短、含胶量高及再生性能好等特点，可被用作杜仲胶提取的理想材料[16]。不同于天然橡胶，杜仲胶在杜仲植株中分布于特化的含胶细胞中，因为杜仲含胶细胞中杜仲胶的含量比较低并且黏度高，因此杜仲胶不能像天然橡胶一样通过割胶直接收集，所以通常需采用物理、化学或生物等方法，如强酸碱或使用生物酶处理破碎植物器官和组织获得杜仲粗胶后，才能实现杜仲胶的有效提取和分离[12,15,17-21]。这些方法中大多以强机械力、强化学作用等引起植物组织破裂，从而分离出杜仲胶，而这样的处理也势必会引起杜仲胶分子结构和聚合度的改变，从而改变杜仲胶的性能[22]。

本研究采用碱浸提法、苯-CH3OH 法和酶水解法对杜仲翅果皮中杜仲胶进行提取，分析不同提取方法对杜仲精胶提取率的影响；同时，对不同方法提取的杜仲胶的热稳定性进行分析，探讨3 种提取法对胶性能的影响，以期为优化杜仲胶的提取工艺、实现杜仲胶的规模化生产提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料及试剂

杜仲翅果为2019年7月采自贵州大学实验农场杜仲资源圃中树龄为15 a 的新鲜翅果。收集的翅果置于烘箱中，经120℃杀青30 min 后90℃下烘干至恒质量，依次经去种留壳、粉碎、过筛（100目）处理得到翅果皮干粉样备用。氢氧化钠、柠檬酸、柠檬酸钠均购于天津科密欧化学试剂有限公司；石油醚、苯、甲醇、乙醚和无水乙醇均购于天津科密欧化学试剂有限公司，均为分析纯；纤维素酶购于和氏璧生物科技有限公司。

索氏提取器，SC 100 恒温金属水浴锅（Thermo），SXKW 数显控温电热套（北京市永光明医疗仪器有限公司），TP-213 电子天平（北京丹佛仪器有限公司），DHG-9070A 电热鼓风干燥箱等仪器（上海一恒科学仪器有限公司），FE 20/EL 20 pH 计（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），92/262 系列（Haier 医用低温保存箱），FZ 102 微型植物粉碎机（上海诺萱科学有限公司），STA 449F3 同步热分析仪（德国布鲁克公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 碱浸提法

参照欧阳辉等[23]、吴可心等[24]和龚兆全等[25]的方法略做改动，准确称量杜仲果皮干粉8.00 g，加入100 mL 10%的NaOH 溶液，90℃下对杜仲果皮进行预处理3 h 后过滤，滤渣用蒸馏水冲洗至pH 为7.0，然后置于50℃烘箱中烘至恒质量得杜仲粗胶。以石油醚作为溶剂在90℃下回流提取26 h，将提取液置于-20℃低温冷冻3 h，待杜仲胶析出后除去（自然挥发）或回收石油醚（离心收集），将提取的杜仲精胶置于37℃烘箱中烘干。每组设3 个重复。

1.2.2 苯-CH3OH 提取法

参照陆志科等[17]的方法略做改动，准确称量杜仲果皮干粉8.00 g，置于索氏提取器中用苯进行浸提26 h，提取液中加入1.5 倍量的CH3OH 沉淀2 h，弃去沉淀液、干燥沉淀物即得杜仲粗胶，再用乙醚溶解，所得白色沉淀物置于37℃烘箱中烘干即为杜仲精胶。每组设3 个重复。

1.2.3 酶水解提取法

参照张学俊等[26]和贺扬洁等[27]的方法略做改动，准确称量杜仲果皮干粉8.00 g。加入浓度为5%的NaOH 溶液100 mL，于37℃水浴中对杜仲果皮进行预处理6 h 后过滤，将滤渣用蒸馏水冲洗至pH 为7.0 后，置于50℃烘箱中烘干至恒质量得杜仲粗胶，加入100 mL 预配置的0.1 g/L 纤维素酶溶液（pH 4.0），放入45℃恒温箱中处理27 h，取出、过滤、烘干后用石油醚作为溶剂在90℃下回流提取26 h，将提取液置于-20℃低温冷冻3 h后析出白色沉淀，弃去石油醚，将白色沉淀置于37℃烘箱中烘干，烘干物即为杜仲精胶。每组设3个重复。

1.2.4 杜仲胶产率

粗胶产率=预处理所得杜仲胶干质量/样品总干质量×100%；

精胶产率=精提所得杜仲胶干质量/样品总干质量×100%。

1.2.5 杜仲胶热稳定性测定

参照Sarina 等[28]、弓铭等[29]和牟悦兴等[30]略做修改，准确称取10 mg 以3 种方法提取的杜仲精胶，样品经室温至700℃变温热分解后，用STA449F3 对杜仲胶的热稳定性进行分析。升温速率为10℃/min，以N2作为保护气体。

1.2.6 数据处理

采用SPSS 26.0 软件对杜仲胶提取率进行单因素方差分析，用LSD 法及Duncan 法进行多重比较及差异显著性分析。

2 结果与分析

2.1 不同提取法对杜仲胶形态的影响

不同提取方法所得杜仲胶形态上存在一定差异。碱浸提法所得杜仲胶整体色泽偏浅黄色，形态结构致密、呈薄块（片）状，胶块延展性一般（图1A）；苯-CH3OH 法所得杜仲胶整体颜色偏暗绿色，形态结构松散，呈凝集的团状，胶块较松软且有一定较粘稠性（图1B）；而酶水解法提取的杜仲胶，整体色泽偏蜡黄色，结构紧凑致密、呈厚块（片）状，胶块的延展性较好（图1C）。

2.2 不同提取法对杜仲粗胶得率的影响

苯-CH3OH 法通过将杜仲胶及非极性物质溶解于苯中溶解粗胶，而碱浸提法和酶水解法主要通过碱液去除角质及极性物质获得粗胶。因此，不同提取方法所得杜仲粗胶得率有一定差异。酶水解法、碱浸提法和苯-CH3OH 法的提取的杜仲粗胶产率分别为56.33%、33.29%和9.94%，说明以酶水解法处理所得粗胶中杂质含量较高，而苯-CH3OH 法所得粗胶杂质最低。

2.3 不同提取方法对杜仲精胶得率的影响

3 种提取法对杜仲精胶得率有一定影响。其中，酶水解法的提取率最高，为5.36%，苯-CH3OH法次之，为4.56%，以碱浸提法的提取率最低，仅为1.85%。另外，酶解法提取后所剩的植物残渣结构松散、无粘稠状，也暗示该方法能有效地将植物细胞壁降解，更好地释放细胞内中橡胶分子。

表2 不同提取方法对杜仲精胶产率的影响Table 2 Effects of different extraction methods on the yield of extracted Eucommia rubber (Mean ± SE)

2.4 不同温度处理对杜仲胶热力学性能的影响

差示扫描量热法（Differential scanning calorimetry，DSC）和热重法（Thermogravimetry，TG）曲线分析杜仲胶热力学性能表明，发现3 种方法提取的杜仲胶在质量损失5%、30%和50%时的温度（分别记为T5%、T30%和T50%）有一定差异，但不显著（表3）。在温度小于300℃的低温区，杜仲胶质量损失微小，推测这主要是由于杜仲胶样品吸附的水分的解吸附造成的；杜仲胶质量损失主要发生在300～470℃范围内（图2），在此温度范围内苯-CH3OH 法所提取的杜仲胶质量损失占总损失的95.05%，而碱浸提法和酶解法所得杜仲胶质量损失分别占总损失的97.33%和97.90%。说明杜仲胶在300～470℃范围内热稳定较差，相比较3 种方法，苯-CH3OH 法提取的杜仲胶损失率较其它两种方法略低。另外，尽管在杜仲胶分解率为5%时，苯-CH3OH 法所得的杜仲胶的热分解温度较碱提法和酶解法的低，但在其分解率为30%和50%时，热分解温度都比后两者高。综上，3 种提取法所得杜仲胶的热稳定性能差异不显著。通过研究碱浸提、苯-CH3OH 法和酶水解法3 种方法提取杜仲胶的结晶吸热曲线（图3）发现杜仲胶的吸热熔融峰只由一个峰型组成，表明用这3 种方法提取的杜仲胶只由1 种结晶晶型组成，推测为α晶型，且3 种方法所得杜仲胶该晶型的熔点分别为70.99℃、67.40℃和69.39℃。通过对比DSC 的吸热光谱图发现，酶水解法所提取的杜仲胶的结晶热焓比另外2 种方法提取的略高。

表3 不同热失重率时杜仲胶的热分解温度Table 3 Decomposition temperature of Eucommia rubber at different thermo-gravimetric rates ℃

图2 不同提取所得杜仲胶TG 曲线分析Fig.2 TG curve of Eucommia rubber with different extraction methods

图3 不同提取所得杜仲胶DSC 曲线分析Fig.3 DSC curve of Eucommia rubber with different extraction methods

3 结论与讨论

杜仲E.ulmoidesOliv.为杜仲科Eucommiaceae杜仲属Eucommia雌雄异株的多年生落叶乔木[31]，杜仲叶片、果皮、树皮及根皮中均含杜仲胶，杜仲胶又称古塔波胶（gutta-percha），是杜仲次生代谢合成的一种重要天然高分子化合物[32]，具有较为广泛的应用价值。本研究以3 种不同方法对杜仲翅果皮中杜仲胶进行提取，其得率存在一定差异。碱浸提法和酶水解法均采用NaOH 进行前期处理获得杜仲粗胶，比较杜仲粗胶得率发现，以NaOH 预处理杜仲翅果皮样品最佳的提取条件为10% NaOH 溶液90℃处理3 h，粗胶得率为33.29%，说明在该条件下大量的极性可溶物质被强碱所分解，而保留了杜仲胶等非极性物质，该结果与陆志科等[17]的实验结果一致。由此推测，随着温度和碱液浓度的升高，纤维素、木质素分解速度加快，树脂成分的皂化速度也加快，即升高温度和碱液浓度有利于翅果壳中的非胶成分分解。另外，3 种提取法中以酶水解法所得粗胶产率和精胶产率都最高，分别为56.33%和5.36%，表明低浓度碱处理结合温和的酶处理不仅能保留大量的胶组分和杂质组分（杜仲粗胶），还能使杂质组分在后续提胶过程中迅速去除，进而实现杜仲精胶的高提取率。尽管酶解法所得杜仲精胶得率较高，但与欧阳辉等[23]以相同方法提取杜仲翅果皮中杜仲胶相比，提取率有一定程度下降，推测造成此现象的原因可能是选用的翅果龄期不同导致的差异，一方面不同月份翅果中胶含量有一定差异[33]，另一方面本实验采用的翅果皮干样过筛（100 目）后引起了杜仲胶组分的丧失，进而导致较低的杜仲胶提取率。

杜仲胶具有优良的耐热性，为了研究这3 种提取法对杜仲胶耐热性能的影响，对杜仲胶热力学分析发现，苯-CH3OH 法所提取的杜仲胶在T30%和T50%热分解温度比其余2 种方法所提杜仲胶略高，但差异不显著；另外，一般认为杜仲胶至少存在两种确定的晶型，即α 晶型和β 晶型，前者适于在高温形成，后者则适于在低温下形成。通过对比张天鑫[34]和刘奇等[13]的研究结果，本研究中3 种方法所得杜仲胶的DSC 曲线只含有一个吸热熔融峰，熔解温度在70℃左右，暗示这些方法所得杜仲胶均为高温形成晶型，即α 晶型。推测造成此现象的原因可能是杜仲植株间品种或提取方法本身的差异导致了杜仲胶的晶型种类和熔解温度的不同。通过对比DSC 曲线的吸热光谱图发现，酶水解法所提取的杜仲胶的结晶热焓比另外2 种方法提取的略高，说明该法所提取的杜仲胶分子结构相似度更高、结晶度更好。因此，在杜仲胶提取的实际生产中可考虑使用苯-CH3OH法和酶水解法。2 种方法相比较，后者不仅可满足杜仲胶得率高、杂质少且所得杜仲胶分子结构一致、结晶度高，而且所使用的试剂温和对植物材料破坏小且对人体危害小。

本研究采用不同提取方法对杜仲翅果皮中的杜仲胶进行提取，其中以酶水解法提取杜仲胶得率最高。进一步通过对所提取的杜仲胶进行性能分析，3 种方法提取所得杜仲胶的耐酸碱性和热稳定性均无显著差异，但对杜仲胶的结晶度有一定影响，以酶水解法提取的杜仲胶得率较高且结晶度也最好。目前，本研究仅在实验室开展杜仲胶提取比较实验，因此如果将该法用于杜仲胶规模化提取，还需进一步摸索酶解提取法的提取工艺参数，以为实现杜仲胶的工业化生产提供理论参考。