苏杰天 姜翠兰 黄兆峰 马玉婷 孟帅帅 宋斌 魏守辉 黄红娟

摘要 ：大穗看麥娘是我国麦田新发生的恶性杂草，与日本看麦娘苗期形态相近，导致难以识别和有效监测。本研究利用4个DNA 条形码候选序列（rbcL、matK、trnH-psbA和ITS2）对13份大穗看麦娘和10份日本看麦娘叶片材料进行分子鉴定，采用Vector NTI分析扩增的DNA序列峰图质量并比对碱基差异，通过MEGA 6.0软件中的K2P模型计算样本种内和种间的双参数遗传距离，采用邻接法构建系统发育树。结果表明，4个DNA 条形码序列中仅matK扩增测序结果不理想。日本看麦娘在4种DNA条形码序列中不存在种内差异，大穗看麦娘在rbcL、matK和ITS2序列中无种内差异，仅在trnH-psbA序列中存在7个差异位点。大穗看麦娘和日本看麦娘种间各DNA条形码序列均有差异，trnH-psbA、rbcL、matK和ITS2序列存在的差异位点数分别为6、3、14和28。ITS2的种间平均遗传距离大于rbcL，且具有特异性，适宜用于大穗看麦娘和日本看麦娘的准确鉴定。

关键词 ：杂草生物学; 种类鉴定; 大穗看麦娘; 日本看麦娘; DNA条形码

中图分类号：

S 451.221， Q 781

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020096

Identification of Alopecurus myosuroides and A.japonicus by DNA barcode

SU Jietian1， JIANG Cuilan1， HUANG Zhaofeng1， MA Yuting2， MENG Shuaishuai1，

SONG Bin3， WEI Shouhui1*， HUANG Hongjuan1*

（1. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China;

2. Shifang Bureau of Agriculture and Rural Affairs， Sichuan Province， Deyang 618400， China;

3. Tianjin Academy of Agricultural Sciences， Tianjin 300192， China）

Abstract

Alopecurus myosuroides is a new emerging worst weed in wheat fields and has similar seedling appearance to A.japonicus. Screening DNA barcode for molecular identification of A.myosuroides and Ajaponicus is crucial for effective weed identification and monitoring. To distinguish the A.myosuroides and Ajaponicus， four DNA barcode fragments， rbcL， matK， trnH-psbA and ITS2 were used for molecular identification of 13 A.myosuroides and 10 A.japonicus samples. The quality of sequence peak map was observed and base differences were compared by Vector NTI software. The two-parameter genetic distance （K2P） was calculated by MEGA 6.0 software， and the phylogenetic tree was constructed by neighbor-joining （NJ）. The results showed that among the four DNA barcodes， only matK amplification sequencing was found to be unsatisfactory. There were seven locus differences in A.myosuroides for trnH-psbA， but no intraspecific difference for rbcL， matK and ITS2 in A.myosuroides and for all the barcoding sequences in A.japonicas. There were interspecific locus differences between A.myosuroides and A.japonicus， the numbers of different locus for trnH-psbA， rbcL， matK and ITS2 were 6， 3， 14 and 28， respectively. The average genetic distance of ITS2 was larger than that of rbcL， which also had specificity. ITS2 was suitable for accurate identification of Amyosuroides and A.japonicus.

Key words

weed biology; species identification; Alopecurus myosuroides; Alopecurus japonicus; DNA barcode

看麦娘属Alopecurus L.植物属于禾本科Gramineae一年生或多年生草本植物。全球有40～50种，主要分布在北半球温带、寒带以及南美洲部分地区，有8种分布于我国[12]，其中日本看麦娘A.japonicus Steud.和大穗看麦娘A.myosuroides Huds.是我国麦田恶性杂草。这些杂草与小麦苗竞争生长资源和空间，降低小麦的抗逆能力，影响小麦的产量和品质[3]。大穗看麦娘现在在我国冬小麦种植区呈快速蔓延的趋势，在山东、河南和河北的一些冬小麦田成为恶性杂草[4]，目前我们在天津、河北、安徽和陕西等省（市）的麦田调查中均发现其高密度发生危害，发生面积逐渐增加，危害也有加重趋势。日本看麦娘在我国分布较广，主要危害稻茬小麦和油菜等夏熟作物。由于除草剂的长期单一使用，日本看麦娘和大穗看麦娘对ALS和ACCase抑制剂都有抗药性发生的报道，大穗看麦娘作为我国新入侵的恶性杂草，对其抗药性研究国外报道较多，国内还缺乏相关的系统报道[513]。因此需要提高对大穗看麦娘的警惕性，及早识别和采取有效措施进行防控，避免大穗看麦娘的蔓延并减少其抗药性的发生。两种杂草幼苗期形态十分相似，通过形态难以进行识别，因此，找到有效且准确鉴别大穗看麦娘和日本看麦娘的方法对于其传播扩散的控制以及除草剂的合理使用至关重要。

DNA条形码（DNA barcode）是生物基因组中能够代表该物种，有足够变异且易扩增的标准化的DNA序列。DNA条形码技术（DNA barcoding）是利用标准的基因片段对物种进行快速鉴定的技术。2003年加拿大科学家Hebert首次提出线粒体基因细胞色素C氧化酶 （cytochrome oxidase Ⅰ，COⅠ）可作为识别动物的手段，建立了识别鳞翅目昆虫的COⅠ模型并得到验证[14]。之后DNA条形码被引入植物学中[15]，现在已经成功用于生物物种分类和鉴定[1618]、生态学调查和生物多样性评估[1921]等研究领域。DNA条形码可利用生物残迹来鉴定形态学无法鉴定的已知或未知物种。在植物鉴定中，对于一些植物种属内形态变异复杂、性状受环境影响大、表型鉴定困难的植物，DNA条形码因具有鉴定快速和准确的优势，得到了广泛的应用。陈小露等[22]用ITS2（internal transcribed spacer 2，核基因核糖体第二内转录间隔区）鉴定61份龙葵Solanum nigrum L.及其近缘种样品，结果表明ITS2能够准确鉴定龙葵及其近缘种。焦丽娟等[23]选用rbcL（叶绿体1，5-二磷酸羧化酶/加氧酶大亚基编码基因rubisco large subunit）、matK（tRNA成熟酶编码基因maturase K）、trnH-psbA（叶绿体基因间隔区序列）和ITS2对中国秋海棠属Begonia L.26个种136个个体进行了分析，由于ITS2种内和种间变异大，鉴定率高，被用作秋海棠属DNA条形码鉴定的候选片段。乌吉斯古楞[24]选用委陵菜属Potentilla L.中22个种的42个居群材料进行了DNA条形码筛选，并进行NJ进化树和ML进化树分析，发现单独片段的matK的ML聚类最理想，组合片段rbcL+matK+trnH-psbA的鉴定效果最好，但组合片段也不能将委陵菜属植物完全分开，其中星毛委陵菜P.acaulis L.存在区分难度。本研究利用DNA条形码技术基于成熟的DNA序列片段rbcL、matK、trnH-psbA以及ITS2进行鉴定筛选，获得最优鉴定序列，设法仅使用1对引物就能成功区分日本看麦娘和大穗看麦娘，实现对两种看麦娘样品的快速、准确鉴定。

1 材料与方法

1.1 试验仪器和试剂

TissueLyser Ⅱ样品破碎仪（北京天根生化科技有限公司），Nanodrop One超微量分光光度计（基因有限公司），T100Tm PCR扩增仪（Bio-Rad公司），ML204电子天平（Mettle-Toledo），1-14离心机（Sigma），JY600C琼脂糖凝胶电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司），Tanon-3500凝胶图像分析系统（北京原平皓生物技术有限公司）。

新型植物基因组DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司），琼脂糖（Biowest Agarose），Gel Red核酸染色剂（Biotium），2×TSINGKE Master Mix、DL 2000 Marker、10×Loading Buffer（北京擎科生物技术有限公司）。

1.2 试验样品和培养

DNA条形码材料：种子样品采集于2017年和2018年，采自 5省13地的小麥田。经成株物种特征比对，鉴定其中有10份日本看麦娘种子和13份大穗看麦娘种子（表1）。特异性验证材料：选用15种麦田禾本科杂草作为特异性验证材料，种子样品采集于2016年和2017年，采自7省（市）10地的小麦田（表2）。按照1∶1∶1的比例混合普通壤土、花卉土（北京丰瑞佳业科技有限公司）和蛭石，选择颗粒饱满的种子样品播种于盆（8.5 cm×8.5 cm×9.5 cm）装土壤中，每盆按照五点法种植，每份样品种2盆，确保其有足够温湿度条件，待长至2～3个叶片时取样。

1.3 DNA提取和检测

取2 mL圆底离心管，每管加入2枚直径为3 mm的无菌钢珠，每份选取100 mg的叶片样品并剪成1 cm小段装入对应编号的离心管，于-80℃冰柜冷冻8 h，取出后使用样品破碎仪将样品破碎至粉状，采用北京天根新型植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，置于-20℃冰箱保存。采用超微量分光光度计检测供试样品DNA浓度，使用1%琼脂糖凝胶电泳进行DNA纯度检测。

1.4 PCR扩增和测序

PCR反应体系（30 μL）：基因组DNA 1 μL、上下游引物各1 μL（各片段引物信息见表3）[25]、12 μL ddH2O和15 μL 2×TSINGKE Master Mix，离心10 s，进行PCR反应。扩增参数：94℃预变性5 min;94℃变性30 s，最适退火温度30 s，72℃延伸30～50 s，共35个循环;72℃延伸10 min。PCR产物使用1%琼脂糖凝胶进行检测并用凝胶图像分析系统观察结果。选择条带清晰、单一的PCR产物由北京擎科新业生物技术有限公司进行双向测序。

1.5 数据分析

利用Vector NTI软件检测基因组DNA序列峰图质量，检查和校对碱基，对基因组DNA序列进行剪切拼接。通过MEGA 6.0软件[26]，计算样本种内和种间的双参数遗传距离（Kimura 2-parameter，K2P），采用邻接法（neighbor-joining，NJ）构建系统发育树[27]，基于K2P模型及自举检验法（bootstrap method）检验各分支的置信值，测定1 000次循环[28]。

2 结果与分析

2.1 样品PCR检测结果

所有样品的DNA浓度范围在41.1～232.3 ng/μL，根据检测结果，用ddH2O将DNA稀释至工作浓度（30～50 ng/μL），其中rbcL、trnH-psbA和ITS2 DNA条形码PCR的扩增效率均达到100%，matK扩增效率为85%。

2.2 大穗看麦娘与日本看麦娘DNA条形码的序列特征

扩增得到大穗看麦娘和日本看麦娘的rbcL序列片段长度为553 bp（比对长度相同），核苷酸差异数3，种内平均遗传距离0，种间平均遗传距离0.005 4。大穗看麦娘和日本看麦娘的ITS2片段长度分别为444 bp和446 bp，比对后长度447 bp，核苷酸差异数28，种内平均遗传距离0，种间平均遗传距离0.056 6。大穗看麦娘和日本看麦娘的matK片段长度为898 bp（比对长度相同），核苷酸差异数14，种内平均遗传距离0，种间平均遗传距离0.015 8，但日本看麦娘种群的matK序列经多次PCR扩增，通常无条带或出现poly结构，测序比对结果不理想。大穗看麦娘和日本看麦娘的trnH-psbA序列片段长度为620 bp（比对长度相同），核苷酸差异数13，种内平均遗传距离0.011 4，种间平均遗传距离0.015 5，大穗看麦娘在该序列中存在种内差异，存在鉴定复杂问题。

序列分析结果表明，各DNA条形码序列差异位点数由大到小依次为ITS2、matK、trnH-psbA和rbcL，GC含量由大到小依次为ITS2、rbcL、trnH-psbA和matK。rbcL、matK和ITS2种内平均遗传距离均为0，但由于matK的PCR扩增测序结果不理想，trnH-psbA序列中存在种内差异，因此不采用，所以仅rbcL和ITS2可用于鉴别日本看麦娘和大穗看麦娘。

2.3 大穗看麦娘与日本看麦娘DNA条形码的差异位点

大穗看麦娘与日本看麦娘在trnH-psbA上存在6个差异位点，在matK上存在14个差异位点，但不能满足鉴别要求。大穗看麦娘与日本看麦娘在rbcL序列中存在3个差异位点，分别是52位T/C、136位A/G、及313位T/G差异。大穗看麦娘与日本看麦娘在ITS2序列中存在28个差异位点，分别是55位T/C、103106位G---/ATAC、114115位TA/CG、120位C/G、123位A/G、139位T/C、149150位TA/GC、154位G/A、170位T/A、184位T/G、188位T/C、240位A/T、244位A/G、247位T/C、255位G/A、259260位AA/GT、263位A/G、267269位TTG/CA-、284位A/C及289位C/T差異（图1）。

2.4 候选DNA条形码的特异性验证

选取13种农田常见的禾本科杂草并随机挑选大穗看麦娘（DS10）和日本看麦娘（RB3）样本各一份（表2），对rbcL和ITS2进行特异性验证。rbcL特异性验证中，经序列比对，只有日本看麦娘在313位碱基为G，不同于其他14份供试材料，但大穗看麦娘在该序列中不存在特异碱基，因此rbcL不具有特异性，不能用于鉴别大穗看麦娘和日本看麦娘。ITS2特异性验证中，大穗看麦娘与日本看麦娘在103-106位存在G---/ATAC碱基差异，均不同于其他供试材料，同时大穗看麦娘在115、123、150位存在特异碱基。证明ITS2在供试材料中存在特异性，可用于鉴别大穗看麦娘和日本看麦娘。

通过MEGA 6.0软件，计算ITS2序列下特异性验证材料中种间的双参数遗传距离。大穗看麦娘与日本看麦娘之间的遗传距离为0.062，大穗看麦娘与其他13份材料的遗传距离为0.062～0.317，日本看麦娘与其他13份材料的遗传距离为0.030～0.307。用邻接法构建ITS2序列下特异性验证材料的系统发育树（图2），基于K2P距离模型及自举检验法检验各分支的置信值，测定1 000次循环。大穗看麦娘和日本看麦娘与用于特异性试验的其他13份材料均存在差异，麦田杂草节节麦Aegilops tauschii Coss.、圆柱山羊草A.cylindrica Host.、菵草Beckmannia syzigachne （Steud.） Fernald、日本看麦娘、鬼蜡烛Phleum paniculatum Huds、大穗看麦娘和硬草Sclerochloa dura （L.） Beauv.聚为一个群，其他类群与本类群的亲缘关系较远。结果表明ITS2能将大穗看麦娘与日本看麦娘分开，并且与其他禾本科杂草也存在明显差异，具有很强的特异性。

3 討论

DNA条形码的通用性方面，本研究扩增的DNA序列区段选用国际生命条形码联盟植物工作组（CBOL Plant Working Group）推荐的应用较为广泛的rbcL、matK、trnH-psbA和ITS2[2930]，这4种DNA区段是陆地植物通用的DNA条形码。matK扩增及测序成功率为85%，且经多次PCR扩增测序结果不理想，不适用于鉴别日本看麦娘和大穗看麦娘，rbcL、trnH-psbA和ITS2的PCR扩增及测序成功率均为100%。

物种鉴定正确性方面，ITS2在大穗看麦娘和日本看麦娘种间的差异位点数较其他DNA条形码多，并且不存在种内差异，具有很好的区分性。相比之下trnH-psbA存在种内差异，不具有很好的区分性。特异性验证中，大穗看麦娘和日本看麦娘的ITS2序列与供试的其他13种禾本科杂草均存在特异碱基差异，证明ITS2序列具有很好的特异性，而rbcL序列中只有日本看麦娘具有特异碱基，不能对大穗看麦娘进行鉴定。

综上所述，ITS2可准确区分大穗看麦娘和日本看麦娘，可对未知的大穗看麦娘和日本看麦娘样本进行快速鉴定，大大提高了鉴定效率，也提高了检测的速度和准确性。同时ITS2存在很强的特异性，对于发现新物种和控制外来入侵也具有重要的价值[31]。本研究的特异性验证材料中没有涉及其他看麦娘属杂草，对于其特异性验证还有待进一步探究。因此，在今后的研究中，应扩大 DNA 条形码技术在看麦娘属植物中的应用，寻找出适合看麦娘属不同种的DNA条形码序列，为实现看麦娘属植物的快速鉴定奠定基础。

参考文献

[1] 丁昕，丁良霞，李建霞，等.中国看麦娘属植物叶表皮微形态研究[J]. 广西植物，2016，36（9）：10461051.

[2] 胡述梅，李建霞，丁良霞，等.中国看麦娘属植物颖片与外稃微形态研究[J]. 西北植物学报，2017，37（10）：19721979.

[3] 朱阿秀，张绍明，鞠国钢，等.近年江苏省麦田杂草发生情况及防除对策[J]. 中国植保导刊，2018，38（7）：5457.

[4] 房锋，李美，高兴祥，等.冬小麦田大穗看麦娘种群动态及对小麦产量的影响[J]. 植物保护学报，2018，45（2）：340346.

[5] 谷涛，李永丰，张自常，等.稻麦轮作区日本看麦娘抗药性水平测定及高效除草剂筛选[J]. 江苏农业科学，2017，45（18）：9497.

[6] 毕亚玲.小麦田日本看麦娘对精噁唑禾草灵和甲基二磺隆的抗性研究[D]. 泰安：山东农业大学，2013.

[7] DCKER R， ZLLNER P， PARCHARIDOU E， et al. Enhanced metabolism causes reduced flufenacet sensitivity in black-grass （Alopecurus myosuroides Huds.） field populations [J]. Pest Management Science， 2019，75（11）： 29963004.

[8] MOHAMED I A， LI Runzhi， YOU Zhenguo， et al. Japanese foxtail （Alopecurus japonicus） resistance to fenoxaprop and pinoxaden in China [J]. Weed Science， 2012，60（2）：167171.

[9] TANG Huaiwu， LI Jun， DONG Liyao， et al. Molecular bases for resistance to acetyl-coenzyme A carboxylase inhibitor in Japanese foxtail （Alopecurus japonicus） [J]. Pest Management of Science， 2012，68（9）：12411247.

[10]XU Hongle， LI Jun， ZHANG Di， et al. Mutations at codon position 1999 of acetyl-CoA carboxylase confer resistance to ACCase-inhibiting herbicides in Japanese foxtail （Alopecurus japonicus） [J]. Pest Management Science， 2014，70（12）：18941901.

[11]CUI Hailan， WANG Cangyue， HAN Yujiao， et al. Cross-resistance of Japanese foxtail （Alopecurus japonicus） to ACCase inhibitors in China [J]. Weed Technology， 2015，29（3）：444450.

[12]MOSS S R， CUSSANS G W. Variability in the susceptibility of Alopecurus myosuroides （black-grass） to chlortoluron and isoproturon [J]. Annals of Applied Biology， 1985（9）：9198.

[13]CUMMINS I， MOOS S， COLE D J， et al. Glutathione transferases in herbicide-resistant and herbicide-susceptible black-grass （Alopecurus myosuroides） [J]. Pesticide Science， 1997，51（3）：244250.

[14]HEBERT P D N， CYWINSKA A， BALL S L， et al. Biological identifications through DNA barcodes[J]. Proceedings of the Royal Society of London. Series B： Biological Sciences， 2003，270（1512）：313321.

[15]CHASE M W， SALAMIN N， WILKINSON M， et al. Land plants and DNA barcodes： short-term and long-term goals [J]. Philosophical Transactions： Biological Sciences， 2005，360（1462）：18891895.

[16]馬丽杰，吴云，谷巍，等.基于ITS2序列的东北透骨草及其混伪品DNA分子鉴定[J]. 中草药， 2019， 50（23）：58305837.

[17]赵玉洋，周骏辉，袁媛，等.麝香的微型DNA条形码鉴别方法研究[J]. 中国现代中药，2019，21（9）： 11861191.

[18]吴田泽，赵小惠，胡心怡，等.中药材DNA条形码鉴定技术应用进展[J]. 中医药导报，2019，25（16）：125130.

[19]李超伦，王敏晓，程方平，等.DNA条形码及其在海洋浮游动物生态学研究中的应用[J]. 生物多样性，2011，19（6）：805814.

[20]蒋红霞.江津塘河鱼类资源及遗传多样性调查研究[D]. 重庆：西南大学，2019.

[21]陈炼，吴琳，王启菲，等.DNA条形码及其在生物多样性研究中的应用[J]. 四川动物，2016，35（6）：942949.

[22]陈小露，柏宁宁，向丽，等.基于DNA条形码鉴定龙葵及其近缘种[J]. 中药材，2017，40（2）：290294.

[23]焦丽娟，税玉民.中国秋海棠属（秋海棠科）植物的DNA条形码评价[J]. 植物分类与资源学报，2013，35（6）：715724.

[24]乌吉斯古楞.DNA条形码候选序列在委陵菜属植物鉴定中的应用[D]. 呼和浩特：内蒙古师范大学，2018.

[25]高连明，刘杰，蔡杰，等.关于植物DNA条形码研究技术规范[J]. 植物分类与资源学报，2012，34（6）：592606.

[26]TAMURA K， STECHER G， PETERSON D， et al. MEGA6： Molecular evolutionary genetics analysis version 6.0 [J]. Molecular Biology and Evolution， 2013，30（12）： 27252729.

[27]SAITOU N， NEI M. The neighbor-joining method： A new method for reconstructing phylogenetic trees [J]. Molecular Biology and Evolution， 1987，4（4）：406425.

[28]FELSENSTEIN J. Confidence limits on phylogenies： An approach using the bootstrap [J]. Evolution， 1985，39（4）：783791.

[29]CBOL Plant Working Group. A DNA barcode for land plants [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2009，106 （31）：1279412797.

[30]LI Dezhu， GAO Lianming， LI Hongtao， et al. Comparative analysis of a large dataset indicates that internal transcribed spacer （ITS） should be incorporated into the core barcode for seed plants [J]. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2011，108（49）：1964119646.

[31]陈岩，张立，刘力，等.我国检疫性有害生物DNA条形码信息系统建设[J]. 植物检疫，2014，28（1）：15.

（责任编辑：田 喆）