徐晗 闫晗 褚晋 缪建锟 杨皓 白元俊 董海

摘要 ：為明确采自辽宁省12个稻区稻曲病菌Ustilaginoidea virens的生物学特性、群体遗传多样性与地理区域的关系。本研究采用生物学方法测定稻曲病菌菌株的生长速率和产孢能力，并采用SPSS 20.0分析软件对稻曲病菌菌株的菌丝生长速率和产孢能力进行相关性分析。提取稻曲病菌基因组DNA，采用特异性引物US、交配型引物MAT、遗传多样性引物ERIC对其进行PCR扩增，通过聚类分析进行群体遗传多样性研究。结果显示：157个稻曲病菌菌株的菌丝生长速率与产孢能力相关系数为0.19。采用稻曲病菌特异性引物US进行扩增，157个菌株均为稻曲病菌株;采用交配型引物MAT进行扩增，53个菌株为MATⅠ型，104个菌株为MATⅡ型。采用ERIC引物可扩增出2～7条不等的条带，157个稻曲病菌株被划分为10个基因类群，其中第1类群为优势类型，有44个菌株，占总数的28.0%;第2类群有20个菌株，占总数的12.7%;第3类群1个菌株，占总数的0.6%;第4类群1个菌株，占总数的0.6%;第5类群有21个菌株，占总数的13.4%;第6类群有17个菌株，占总数的10.8%;第7类群有2个菌株，占总数的1.2%;第8类群有5个菌株，占总数的3.2%;第9类群有30个菌株，占总数的19.1%;第10类群有16个菌株，占总数的10.2%。来自辽宁省12个稻区的157个稻曲病菌株菌丝生长速率与菌株产孢量之间没有相关性，产孢量与地域之间有相关性。基于ERIC-PCR扩增的稻曲病菌株基因组DNA指纹图谱的多态性进行划分的基因类群与地理区域之间有相关性，基因类群与生物学特性之间没有相关性。

关键词 ：稻曲病菌; 辽宁稻区; 生物学特性; 群体遗传多样性

中图分类号：

S 435.111

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020126

Biological characteristics and genetic diversity of Ustilaginoidea virens

from rice regions in Liaoning province

XU Han， YAN Han， CHU Jin， MIAO Jiankun， YANG Hao， BAI Yuanjun， DONG Hai*

（Liaoning Academy of Agricultural Sciences， Shenyang 110161， China）

Abstract

The object of this study is to reveal the relationship among geographical regions， biological characteristics and genetic diversity of Ustilaginoidea virens from 12 regions in Liaoning province. Sporulation and growth rate of these strains were determined， and relativity was analyzed by using the software SPSS 20.0. DNA was extracted from the strains， the genomic fingerprint profiles were generated by specific primers US， mating type primers MAT， genetic diversity primers ERIC， respectively. Their genetic diversities were further investigated by using clustering analysis. The correlation coefficient of growth rate of these strains and sporulation was 0.19. The genomic fingerprint profiles of 157 strains were generated by specific primers US， and all these strains were false smut rice strains. Genome-wide DNA amplification by mating type primers MAT showed that 53 strains were MATⅠtype and 104 strains were MATⅡtype. two to seven polymorphic bands of each examined isolate could be detected by ERIC-PCR analysis. Ten clusters were grouped based on cluster analysis. The predominant group was the first group， including 44 strains （28.0%）. The second group had 20 strains （12.7%）. Only one strains was found in the third group （0.6%） or the fourth group （0.6%）. The fifth to tenth group included 21 strains （13.4%）， 17 strains （10.8%）， 2 strains （1.2%）， 5 strains （3.2%）， 30 strains （19.1%） and 16 strains （10.2%）， respectively. As for 157 U.virens strains from 12 regions in Liaoning province， there were no relativity between the growth rate and sporulation， but significant relationship between sporulation and geographical regions. Analysis based on DNA fingerprinting of U.virens strains reveal that there was significant correlation between ERIC groups and geographical regions， and no correlation between ERIC group and biological characteristics.

Key words

Ustilaginoidea virens; rice region in Liaoning province; biological property; genetic diversity

水稻稻曲病是由稻曲病菌Ustilaginoidea virens （Cooke） Tak.侵染引起的水稻真菌病害，在世界各水稻产区均有发生[14]。稻曲病的发生会造成稻穗空秕率增加，水稻产量下降;同时，稻曲球含有的稻曲菌毒素可以引起人畜中毒[57]。近年来，由于栽培制度的改变和高产感病品种的推广，使稻曲病的发生逐年加重[89]。辽宁省地跨近5个纬度（38°43′N-43°26′N），由南向北550 km均有水稻种植。在水稻种植区域内，地形条件复杂，山地、丘陵、平原一应俱全，从而形成了复杂多样的气候条件。各稻区种植的水稻品种不尽相同，例如东港稻区种植的水稻品种生育期平均165 d，而岫岩稻区种植的水稻品种生育期仅为130 d左右。各稻区水稻种植品种的不同为稻曲病菌的研究提供了很好的基础。

稻曲病在辽宁省各稻区均有发生，其病原菌种群的分布和变异可为该病害防治提供重要信息。潘雅姣等利用AFLP标记对北京昌平地区菌株进行多样性分析，结果显示同一田块菌株的相似性达072，来自同一小区菌株能聚到同一亚类[10]。周永力等利用RAPD标记对不同省份稻曲病菌进行多样性分析，结果显示寄主对稻曲病菌群体的基因型无显著影响，不同年份采集的菌株遗传多样性不存在显著差异[11]。近年来，随着新型分子标记的出现，稻曲病菌的群体遗传多样性及遗传结构的研究取得了新的进展。李竞生利用ERIC标记分析了四川省60个菌株的遗传结构，发现稻曲病菌在一定的空间范围内存在遗传变异，但遗传变异程度不大[12]。王文斌等对中国10个水稻生产省份111个稻曲病菌菌株分析显示，稻曲病菌基因类群与地理区域之间有一定的相关性;并且来自辽宁省的菌株形成了本地区特有的生物学特性和群体遗传多样性，与其他省份菌株之间有较大差异[13]。

辽宁省各水稻產区生态环境和气候条件有一定的差异，稻曲病菌生物学特性、遗传结构是否各有特点，是否与所在的地理区域有相关性等的研究还鲜有报道。

本文对2017年-2018年在辽宁省12个稻区采集并分离纯化的稻曲病菌菌株的生物学特性，以及各菌株基因组的ERIC遗传多态性进行分析，探明了辽宁稻区稻曲病菌菌株的生物学特性、群体遗传多样性与所在地理区域的关系，为抗稻曲病品种的推广和稻曲病的综合防治提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 稻曲病标样

2017年-2018年在辽宁省苏家屯（SJT）、东港市（DG）、灯塔市（DT）、盘锦市（PS）、沈北新区（SB）、本溪市（HR）、抚顺市（FS）、鞍山市（AS）、宽甸县（KD）、凤城市（FC）、大石桥市（DSQ）和开原市（KY）12个稻区采集当地自然发病的稻曲病标样。

1.1.2 培养基成分

PSA：马铃薯200 g、蔗糖20 g、琼脂18 g，加水至1 L。

PS：马铃薯200 g、蔗糖20 g，加水至1 L。

1.2 试验方法

1.2.1 菌株分离

参照新鲜稻曲病菌分离方法[14]，从12个稻区采集的稻曲球中分离纯化获得单孢菌株。

1.2.2 菌丝生长速率测定

用直径为6 mm的打孔器从PSA培养基上生长的单孢菌落边缘打取菌饼，将其放入PSA培养基平板（90 mm）中央，28℃下培养，3次重复。在第20天用十字交叉法测量菌落直径，并记录菌落背面的色泽。颜色分类标准参照李燕等[15]的方法。参考王文斌等[13]的分类标准，将菌株分为2种生长速率类型：生长速率慢（<2 mm/d）、生长速率快（≥2 mm/d）。

1.2.3 产孢能力测定

选取稻曲病菌2代菌株，在菌落边缘用直径6 mm的打孔器打取8个菌饼移至含有150 mL PS的三角瓶中，27℃、130 r/min振荡培养6 d，充分摇匀后用血球计数板计数孢子数。将菌株分为2种产孢类型：产孢量少（<106个/mL）、产孢量多（≥106个/mL）。

1.2.4 菌株生物学特性数据处理

采用SPSS 20.0分析软件，计算菌株产孢能力与生长速率的相关系数，并根据相关系数分析相关程度：R<0负相关，R=0无线性相关，|R|>0.95显著相关;|R|>0.8高度相关;0.5≤|R|<0.8中度相关;0.3≤|R|<0.5低度相关;|R|<0.3关系极弱，认为不相关。

1.2.5 PCR扩增反应

试验引物合成由上海生工生物工程有限公司完成，所用引物见表1。

采用天根生物公司的基因组DNA提取试剂盒提取供试菌株DNA。检测DNA样品纯度，并保存于-20℃。PCR反应体系为25 μL，其中Mix 12.5 μL，每个引物1 μL，模板DNA 1 μL，ddH2O 9.5 μL。US及MAT引物的扩增程序：94℃ 10 min;94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，循环30次;72℃延伸10 min。ERIC引物的扩增程序：95℃ 7 min;90℃ 30 s，52℃ 1 min，65℃ 8 min，循环35次;65℃延伸10 min[1620]。

1.2.6 扩增产物检测及数据处理

扩增结束后，取5 μL扩增产物用2%琼脂糖凝胶进行电泳检测。凝胶成像系统拍照保存。电泳图谱中的每一条条带均作为1个分子标记，扩增片段的出现与否分别赋值“1”和“0”，制成0-1表用于数据处理。利用ape程序包进行数据处理，以邻接法（neighbor-joining method）得到聚类图。

2 结果与分析

2.1 水稻稻曲病菌生物学特性及其相关分析

本研究共分离得到157株稻曲病菌菌株，其中来自辽宁省苏家屯（SJT）10株、东港市（DG）51株、灯塔市（DT）10株、盘锦市（PS）22株、沈北新区（SB）9株、本溪市（HR）5株、抚顺市（FS）12株、鞍山市（AS）10株、宽甸县（KD）7株、凤城市（FC）10株、大石桥市（DSQ）7株和开原市（KY）4株。各菌株生长速率及产孢量等生物学特性见表2。

供试菌株在PSA培养基上的菌落直径、菌落形态和菌落背面的颜色有差异（图1）。DG-25菌株的菌落生长速度为（2.15±0.18）mm/d，气生菌丝较疏松，菌落边缘规则，背面呈白色;DT-9菌株的菌落生长速度为（2.25±0.09） mm/d，菌丝较致密，边缘规则，背面呈黄绿色;DSQ-2菌株的菌落生长速度为（2.11±0.04）mm/d，菌丝较疏松，边缘规则，背面呈绿色;DT-2菌株的菌落生长速度为（183±012）mm/d，菌丝较致密，边缘不规则，背面呈墨绿色。试验结果表明，稻曲病菌的生长速率在相同的培养条件下稳定，3次重复培养的菌落背面色泽一致。157个菌株中5个白色菌株，菌落平均生长速率为（2.21±0.12）mm/d;56个黄绿色菌株，菌落平均生长速率为（2.19±0.09）mm/d;80个绿色菌株，菌落平均生长速率为（2.08±0.12）mm/d;16个墨绿色菌株，菌落平均生长速率为（1.86±012）mm/d。所有菌株中以菌落背面颜色呈黄绿色和绿色的居多，一般而言，菌落背面呈白色的，菌落生长较快;菌落背面呈墨绿色的，菌落生长较慢。菌株具体信息见表2。

各稻区菌株的生物学特性见表3。可以看出，全部12个稻区均包含生长速率慢或快的菌株和产孢量少或多的菌株。将各个稻区菌株的生长速率以及产孢量计算出平均值并作图（图2）。由图2可以看出，各地菌株生长速率相差不大，但是产孢量相差较大。由此可见，稻曲病菌菌株生长速率与地域相关性较小，产孢量与地域有相关性。用SPSS 20.0分析软件，对157个菌株的生长速率与产孢量进行分析，二者之间的相关系数R=0.19，表明所分析的数据不具有统计学意义，说明稻曲病菌菌株生长速率与菌株产孢量之间没有相关性。

2.2 稻曲病菌分子指紋图谱及其分析

采用稻曲病菌特异性引物对供试157株菌株进行检测，所有菌株有且仅有一条目标扩增片段，无任何杂带产生，其扩增出的特异性片段长度为380 bp（图3），所有菌株均为稻曲病菌。

采用MAT两对引物对供试菌株进行PCR扩增，试验结果见表2，MATⅠ扩增片段长度为233 bp， MATⅡ扩增片段长度为371 bp。一个菌株若能用MATⅠ扩增出条带，则不能用MATⅡ扩增出条带;同理，若不能用MATⅠ扩增出条带，则能用MATⅡ扩增出条带。由此可见，稻曲病菌每个菌株仅为一种交配型（图4）。157个菌株中有53个菌株为MATⅠ型，104个菌株为MATⅡ型，MATⅠ型与MATⅡ型出现比例约为1∶2。

根据ERIC-PCR扩增的DNA指纹图谱的多态性（图5），对157个菌株进行聚类（图6）。依据聚类分析图，157个稻曲病菌菌株被分为10个基因类群（表4）。第1类群包含来自10个稻区的44个菌株，占被测菌株总数的28.0%;第2类群来自6个稻区，共有20个菌株，占被测菌株总数的12.7%;第3类群

只有东港1个菌株，占被测菌株总数的0.6%;第4类群只有沈北新区1个菌株，占被测菌株总数的0.6%;第5类群来自7个稻区，共有21个菌株，占被测菌株总数的13.4%;第6类群来自2个稻区，共有17个菌株，占被测菌株总数的10.8%;第7类群来自鞍山2个菌株，占被测菌株总数的1.2%;第8类群来自3个稻区，共有菌株5株，占被测菌株总数的3.2%;第9类群来自2个稻区，共有菌株30个，占被测菌株总数的19.1%;第10类群来自5个稻区，共有菌株16个，占被测菌株总数的10.2%。聚类分析结果表明，基于ERIC-PCR扩增的稻曲病菌基因组DNA指纹图谱多态性划分的基因类群与菌株采集稻区区域有一定的相关性。来自苏家屯（SJT）、灯塔（DT）、本溪（HR）、抚顺（FS）、凤城（FC）、大石桥（DSQ）和开原（KY）的菌株都聚在两个类群中，说明这些地区的稻曲病菌菌株遗传物质有较高的同源性，基因结构相似性大;来自东港（DG）和盘锦（PS）的稻曲病菌菌株分别分在7个和6个类群中，说明这些稻区的稻曲病菌菌株遗传物质有较大的差异。

比较稻曲病菌菌株的基因类群和生长速率、产孢量、交配型之间的关系，由表5可以看出，在7个基因类群里都包含生长速率慢或快、产孢量少或多、交配型Ⅰ或Ⅱ菌株;由此可见，稻曲病菌菌株的基因类群与生物学特性之间没有相关性。

3 结论与讨论

本研究对2017年-2018年辽宁省12个稻区的157个稻曲病菌菌株进行了生物学特性测定。试验结果表明，各地采集分离的稻曲病菌菌丝生长速率相差不大，产孢量与地区有一定相关性，菌丝生长速率与产孢量没有相关性。菌丝生长速率与菌株产生色素有一定关系，试验发现白色菌丝菌株普遍生长速率较快，深绿色菌丝菌株生长速率最慢。通过前期试验发现，随着继代培养代数的增加，菌株生长速率会加快，产孢能力降低，这与贾切[21]的报道是一致的。因此本研究采用相同继代培养代数的菌株，排除了不同继代培养代数对生长速率、产孢量的影响。

ERIC-PCR是Rep-PCR技术中的一种，目前广泛应用于植物病原菌分类、检测及病原物群体遗传多样性分析。Rep-PCR是基于基因组重复序列的一类分析DNA指纹图谱的技术，操作简便，重复性好[22]。本试验结果表明，基于ERIC-PCR扩增的稻曲病菌基因组DNA指纹图谱多态性划分的基因类群与菌株采集稻区区域有一定的相关性。来自苏家屯（SJT）、灯塔（DT）、本溪（HR）、抚顺（FS）、凤城（FC）、大石桥（DSQ）和开原（KY）的菌株都聚在两个类群中，说明这些地区的稻曲病菌菌株有较高的同源性，基因结构相似性大;来自东港（DG）和盘锦（PS）的稻曲病菌菌株分别分在7个和6个类群中，说明这些稻区的稻曲病菌菌株有较大的差异。因此，在水稻抗稻曲病品种布局和稻曲病综合防控时，需考虑各个稻区稻曲病菌菌株之间的群体遗传多样性等方面的差异，采取合适的方法，以达到稻曲病防控的最佳效果。本试验用ERIC-PCR技术划分的稻曲病基因类群与菌丝生长速率和产孢量之间不存在相关性，与李燕等[23]研究结果相似。

稻曲病有性世代产生的子囊孢子是稻曲病菌的主要侵染来源之一，真菌有性繁殖过程中交配型基因对其性别控制起着决定性作用[24]。真菌的交配型是控制其交配亲和性和有性繁殖的遗传基础，已知的真菌交配型系统分为同宗配合和异宗配合[25]。已有研究报道MATⅠ和MATⅡ共同存在才能形成有受精能力的子座;只有其中一个不能形成成熟的子座[26]。本研究采用两对引物对157个菌株测定了交配型，都有且只有一条条带出现，没有菌株出现两条条带，也就是说菌株只属于MATⅠ型或MATⅡ型。于俊杰等[27]将不同交配型基因的稻曲病菌株配对接种获得菌核，观察子座和子囊孢子形成情况，初步推断稻曲病菌为异宗配合真菌。笔者参照王疏的方法[28]利用大米粒培养基对稻曲病菌进行培养，尝试将具有不同交配型基因的稻曲病菌菌株进行配对，但用MATⅠ型单个菌株、MATⅡ型单个菌株、多个MATⅠ型菌株混合、多个MATⅡ型菌株混合或MATⅠ型与MATⅡ型菌株混合培养，均没有形成子座。通常，异宗配合真菌可亲和的不同交配型的细胞间经过细胞识别、质配、核配和减数分裂等过程产生有性后代[29]，由于样本数量的局限性，在自然条件下是否存在同时具有两个交配型的稻曲病菌菌株，还有待收集和检测更多的菌株，这些不同交配型细胞所处状态及子实体形成机制有待进一步的研究。

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（责任编辑：杨明丽）