肖建飞 韩岚岚 赵奎军 郝子茹 朱琳 师正浩 高丽瞳 陈娟

摘要 ：为了筛选合适的介质以提高昆虫病原线虫抵抗紫外胁迫的能力，本文研究了储存于木质素磺酸钙、预胶化淀粉、蛭石、黑炭和无菌蒸馏水（CK）中的海滨斯氏线虫Steinernema litorale在距18 W紫外灯30 cm处照射30、60、90 min和120 min的存活率、对大蜡螟Galleria mellonella末龄幼虫致死率和水平运动能力的差异。紫外胁迫后，不同介质中储存的海滨斯氏线虫的平均存活率从大到小依次为预胶化淀粉（69.39%）、木质素磺酸钙（51.75%）、蛭石（48.06%）、无菌蒸馏水（47.17%）、黑炭（16.92%）。储存于木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫经紫外胁迫30 min后处理

大蜡螟幼虫，其72 h的校正致死率在93.33%～96.67%;紫外胁迫60 min后，储存于预胶化淀粉、蛭石、木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫对大蜡螟幼虫的校正致死率在83.33%～90.00%;紫外胁迫90 min后，储存于蛭石中海滨斯氏线虫对大蜡螟幼虫的校正致死率在90.00%～96.67%;紫外胁迫120 min后，5种介质中的海滨斯氏线虫对大蜡螟幼虫的校正致死率在60.00%～76.67%，无显著差异（P>0.05）。紫外胁迫4个处理中，储存于木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫24 h后92.33%～96.67%的个体运动到3.6 cm圓孔中。研究结果表明，与测定的其他介质相比，木质素磺酸钙能显著提高海滨斯氏线虫抗紫外胁迫的能力。因此，推荐使用木质素磺酸钙储存海滨斯氏线虫，以增强其对紫外线的耐受能力。

关键词 ：紫外胁迫; 不同介质; 海滨斯氏线虫; 生活力; 生物防治

中图分类号：

S 476.15

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020033

Effects of different media on the resistance of Steinernema litorale to

ultraviolet radiation

XIAO Jianfei， HAN Lanlan*， ZHAO Kuijun*， HAO Ziru， ZHU Lin， SHI Zhenghao， GAO Litong， CHEN Juan

（College of Agriculture， Northeast Agricultural University， Harbin 150030， China）

Abstract

In order to screen appropriate media to enhance the resistance of entomopathogenic nematodes to UV radiation，the Steinernema litorale stored in calcium lignosulfonate， pregelatinized starch， vermiculite， black carbon， and sterile distilled water （CK）， were exposed to 18 W UV lamp at 30 cm for 30， 60， 90 and 120 minutes. The survival rates of S.litorale after UV irradiation， the mortalities of the last instar larvae of Galleria mellonella treated by survival S.litorale for 72 hours and the transverse diffusion ability of survival S.litorale were investigated. The results showed that after UV irradiation， the average survival rates of S.litorale was 69.39%， 51.75%， 48.06%， 47.17% and 16.92% for media of pregelatinized starch， calcium lignosulfonate， vermiculite， sterile distilled water and black carbon， respectively. The corrected mortalities of G.mellonella was 93.33%-96.67% when treated for 72 hours by S.litorale stored in calcium lignosulfonate and survived 30 min UV irradiation. The corrected mortality of G.mellonella treated by S.litorale for 72 hours were 83.33%-90.00% when S.litorale stored in calcium lignosulfonate， pregelatinized starch and vermiculite and exposed to UV radiation for 60 min， and the corrected mortalities of G.mellonella larvae were 90.00%-96.67% when Slitorale stored in vermiculite and exposed to UV radiation for 90 min. The corrected mortality of G.mellonella treated with S.litorale stored in five media and exposed to UV radiation for 120 min were 60.00%-76.67%， and showed no significant difference （P>0.05）. There was 92.33%-96.67% individuals that stored in calcium lignosulfonate could move 3.6 cm to reach the circular hole in 24 hours in all treatments. The results showed that calcium lignosulfonate had the best protection for S.litorale in resistance to UV radiation. Therefore， the calcium lignosulfonate was recommended to store the S.litorale.

Key words

ultraviolet stress; different media; Steinernema litorale; life activity; biological control

昆虫病原线虫（entomopathogenic nematodes）是一种广泛分布在土壤中，通过寄生昆虫而进行生殖繁衍的致病性线虫[1]。对昆虫病原线虫国内地理分布调查发现，斯氏线虫科和异小杆线虫科的线虫大约有200多种[2]。线虫在寄生过程中，通过释放体内的共生菌杀死寄主昆虫，并获取营养，是重要的生防资源。昆虫病原线虫作为最具潜力的生物杀虫剂之一，具有很高的应用价值和市场需求。海滨斯氏线虫Steinernema litorale是由Yoshida诱集和鉴定的昆虫病原线虫，该线虫在低温条件下具有较高侵染力和长时间的耐干燥特性，且低温驯化可以提高其适应低温能力，延长贮存时间[36]。这些优良特性表明海滨斯氏线虫在实际应用方面值得深入研究。

研究表明，不同介质对线虫的生命活动产生不同影响。其中蛭石、沙土、海绵和珍珠岩4种介质对嗜菌异小杆线虫Heterorhabditis bacteriophora冷冻存储存活率有影响，-4℃储存5 d，含水量50%的蛭石中嗜菌异小杆线虫回收率高达87.4%优于其他介质[7];另外，在15、25℃和35℃下，用蛭石和凝胶储存芜菁夜蛾斯氏线虫Steinernema feltiae的效果明显优于泥炭和硅藻土[8]。研究发现，S.feltiae与海藻酸钙混合制成的线虫颗粒，可延长该线虫在室温下的保存时间和保持稳定的侵染力[9]。

昆虫病原线虫对草地贪夜蛾、菜青虫、小菜蛾等叶面害虫有很好的防治效果[1012]，与其他生物杀虫剂相比较，昆虫病原线虫易受到各种非生物胁迫（高温、低湿、紫外辐射等）[1316]和生物因素（微生物和自身生命活动等）的影响，其中紫外线是造成昆虫病原线虫对叶面害虫的田间防治效果差的主要因素之一[1718]。研究发现，长时间的紫外线照射能够杀死秀丽隐杆线虫Caenorhabditis elegans，并且导致该线虫在发育过程中出现畸形，并对该线虫的DNA造成损伤，导致生殖毒性效应[1920]。另外，经20 W和40 W紫外灯照射后，斯氏属和异小杆属的4种昆虫病原线虫的9个品系的存活率和侵染力均有不同程度的变化，部分品系线虫引起寄主提前死亡[16]。因此，探究如何减少紫外辐射对昆虫病原线虫造成的损伤是线虫进一步开发应用的基础。选择合适的抗紫外线介质可以使昆虫病原线虫保持良好的生命活力，提高其对害虫的防治效果。

本文以海滨斯氏线虫为研究对象，探究5种介质对海滨斯氏线虫抗紫外胁迫的影响，旨在为昆虫病原线虫抗紫外研究和叶面施用等提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 供试线虫、昆虫和介质

供试线虫：海滨斯氏线虫是由本实验室从哈尔滨原生态榆树林根际土壤中分离、鉴定，并保存于4℃冰箱中。

供试昆虫：大蜡螟Galleria mellonella L.末龄幼虫购于天津玉米虫养殖场。

供试介质：黑炭、蛭石、木质素磺酸钙、预胶化淀粉和无菌蒸馏水，其中无菌蒸馏水为对照，黑炭和蛭石不溶于水，木質素磺酸钙溶于水，预胶化淀粉与水混合后，在静置状态下少部分溶于水，均匀搅拌后，短时间内与水形成浑浊溶液。

1.2 紫外胁迫对不同介质中的海滨斯氏线虫存活率的影响

准备12个224 mL的透气玻璃组织培养瓶，每瓶加入5 g木质素磺酸钙和18 mL无菌蒸馏水，然后加入2 mL侵染期线虫（浓度为5 000 IJS/mL）。紫外胁迫参考钱秀娟[21]的方法，在18 W紫外灯30 cm处胁迫（以下简称：紫外胁迫）处理30、60、90 min和120 min，每个处理重复3次。将上述处理的线虫在室温下静置30 min，然后采用过筛蔗糖梯度离心法[2224]分离回收线虫，在解剖镜下观察存活状况，用昆虫针刺激线虫，虫体摆动视为存活，记录存活数，计算存活率。蛭石、黑炭、预胶化淀粉和无菌蒸馏水（CK）也按照上述方法处理。线虫保存方法为浅水层保存法。

线虫存活率=线虫存活数/总线虫数×100%。

1.3 紫外胁迫对不同介质中海滨斯氏线虫杀虫活性的影响

将上述处理后的存活线虫配制成浓度为250 IJS/mL的线虫悬浮液。在9 cm的玻璃培养皿中铺双层中性滤纸，放入大蜡螟末龄幼虫10头/皿。然后取2 mL线虫悬浮液，均匀喷洒在滤纸上，放入25℃无光恒温培养箱中培养，重复3次，处理24、48、72 h和96 h时观察大蜡螟末龄幼虫的死亡情况，记录死亡数，计算校正致死率，以无菌蒸馏水为对照。

校正致死率=（x-y）/（1- y）×100%，其中x为处理组的死亡率，y为无菌蒸馏水对照组的死亡率。

1.4 紫外胁迫对不同介质中的海滨斯氏线虫水平运动能力的分析

将上述处理后的存活线虫，配制成浓度为1 000 IJS/mL的线虫悬浮液。其水平运动能力的测定参考杨秀芬[25]和Wright[26]的方法。将1%琼脂倒入直径9 cm的培养皿内，冷却后，在培养基中心用打孔器打1个半径为0.5 cm的圆孔，然后在孔中加入1 mL磷酸缓冲液（PBS）提取的健康大蜡螟末龄幼虫体液，将直径为1 cm的圆形滤纸片放于距圆孔距离3.6 cm（滤纸片圆心距圆孔边缘的距离）处，吸取100 μL线虫液加在滤纸片中心上，然后放入25℃的无光恒温培养箱内，每组重复3次，处理12 h和24 h时，观察并记录运动到圆孔中的线虫数，计算百分比。

具有运动能力的线虫百分比=圆孔中的线虫数/总线虫数×100%。

1.5 数据处理

用Excel 2016进行试验数据处理，用SPSS 23进行One-way ANOVA方差分析。

2 结果与分析

2.1 紫外胁迫对不同介质中的海滨斯氏线虫存活率的影响

紫外胁迫30、60、90 min和120 min后，不同介质中的海滨斯氏线虫的平均存活率依次为预胶化淀粉（69.39%）、木质素磺酸钙（51.75%）、蛭石（48.06%）、无菌蒸馏水（47.17%）和黑炭（16.92%）。紫外胁迫30 min后，储存于无菌蒸馏水（CK）、木质素磺酸钙和预胶化淀粉中的线虫存活率分别为85.67%、81.55%和80.88%，三者之间无显著差异（P>0.05），储存于蛭石中的线虫存活率为58.89%，与前三者相比较，差异显著（P<0.05）。紫外胁迫60、90 min和120 min后，储存于预胶化淀粉中的线虫的存活率分别为75.00%、62.78%和58.89%，均显著高于无菌蒸馏水（CK）中的线虫存活率（P<0.05）。另外，紫外胁迫各处理时间下，储存于黑炭中的线虫存活率均显著低于储存于无菌蒸馏水（CK）中的线虫存活率（P<0.05）。结果表明，预胶化淀粉可提高海滨斯氏线虫在紫外胁迫下的存活率，优于其他介质。

2.2 紫外胁迫对不同介质中的海滨斯氏线虫杀虫活性的影响

如图2a～d所示，紫外胁迫后，储存于木质素磺酸钙和蛭石中的海滨斯氏线虫在24 h时就表现出对大蜡螟末龄幼虫的致病力，其侵染速率比其他介质中的海滨斯氏线虫对大蜡螟侵染速率快。且与储存于木质素磺酸钙和无菌蒸馏水（CK）中的海滨斯氏线虫对大蜡螟的致死率相一致（P>0.05）。其次，储存于黑炭中的海滨斯氏线虫在48 h时对大蜡螟的致死时间相较于储存于无菌蒸馏水（CK）和木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫对大蜡螟的致死时间有所延长。另外，紫外胁迫30、60 min和90 min后，侵染72 h后，储存于无菌蒸馏水（CK）和木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫对大蜡螟的致死率均在80%以上，显著高于储存于预胶化淀粉中的海滨斯氏线虫对大蜡螟的致死率（P<0.05）。紫外胁迫120 min后，侵染48 h时，储存于预胶化淀粉和黑炭中的海滨斯氏线虫对大蜡螟的致死率分别为56.67%和26.67%，差异显著（P<005）。侵染72 h后，5种介质中的海滨斯氏线虫对大蜡螟的致死率无显著差异（P>0.05）。

2.3 紫外胁迫对不同介质中海滨斯氏线虫水平运动能力的影响

由图3a～d所示，紫外胁迫30、60、90 min和120 min后，储存于木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫有92.33%～96.67%的个体在24 h时可运动至圆孔处，显著高于其他介质中的海滨斯氏线虫（P<0.05），储存于蛭石和黑炭中的海滨斯氏线虫水平运动能力差异不显著（P>0.05）。紫外胁迫30和60 min后，储存于无菌蒸馏水（CK）中的海滨斯氏线虫在24 h时能运动到圆孔的个体所占比例分别为67.67%和59.67%，显著高于储存于预胶化淀粉、黑炭和蛭石中的海滨斯氏线虫（P<0.05）。紫外胁迫90 min后，储存于预胶化淀粉、黑炭、蛭石和无菌蒸馏水（CK）中的海滨斯氏线虫运动能力无显著差异（P>0.05）。紫外胁迫120 min后，储存于预胶化淀粉中的海滨斯氏线虫在24 h时能运动到圆孔的个体所占比例为62.67%，显著高于储存于无菌蒸馏水（CK）、黑炭和蛭石中的海滨斯氏线虫（P<0.05）。上述结果表明，紫外胁迫下，木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫的水平运动能力增强，有利于保持海滨斯氏线虫对寄主昆虫的搜索能力。

3 讨论

本研究中所选用的黑炭、蛭石、木质素磺酸钙和预胶化淀粉4种介质在昆虫病原线虫研究或土壤改良等方面均有不同程度的应用，木质素磺酸钙具有良好的分散性，预胶化淀粉具有良好的流动性、黏合性和崩解性，这些特性使它们在昆虫病原线虫颗粒剂研发中得到很好的应用，而且，木质素对紫外线有一定的吸收作用[2735]。蛭石和黑炭均具有良好的透气性，蛭石良好的透气性使其在昆虫病原线虫活体繁殖方面得到了应用[36]。因此，这4种介质均有可能成为昆虫病原线虫较理想的载体，但是这些介质能否提高海滨斯氏线虫抗紫外胁迫的能力尚不明确。基于这些原因，我们开展了以上的研究。

研究发现，从线虫存活率、杀虫活性和水平运动能力3方面分析，虽然储存于预胶化淀粉中的海滨斯氏线虫存活率较高，但是在杀虫活性和水平运动能力方面，明显低于储存于木质素磺酸钙中的海滨斯氏线虫。综合考虑，木质素磺酸钙应是海滨斯氏线虫抵抗紫外胁迫介质的第一选择。

另外，研究发现，无菌蒸馏水（CK）中的海滨斯氏线虫随着紫外胁迫时间的延长，其存活率和对大蜡螟的致死率均有不同程度的下降。这与Gaugler研究的Neoaplectana carpocapsae经紫外线照射不同时间后线虫存活率和致病力下降的结果一致[18]。紫外胁迫30 min后，海滨斯氏线虫存活率在80%以上，这个结果与Heterorhabditis brevicaudis和Sfeltiae不同品系经紫外照射30 min后线虫存活率在80%以上的结果一致[16]。这说明海滨斯氏线虫对紫外胁迫同样具有一定的耐受能力。同时，紫外胁迫120 min比胁迫90 min时线虫的水平运动能力稍强。这可能是由于随着紫外胁迫压力的增大，线虫抵抗这种胁迫的相关代谢活动加强，促使其短时间内运动能力增强，这与相关研究推测的紫外胁迫会对昆虫病原线虫的迁移能力产生影响的结論相互印证[13，16，21，37]。另外，当紫外胁迫达到一定程度后，线虫体内的部分相关基因会选择沉默或被激活，从而会激发并加强了线虫抗氧化能力及能量代谢，以便尽可能地降低体内活化氧等物质引起的伤害[13，21，38]。紫外胁迫引起海滨斯氏线虫体内相关基因的表达发生怎样的变化，尚有待于进一步的研究。

综上，木质素磺酸钙是昆虫病原线虫较理想的抗紫外介质，其在抗紫外的同时能较好地保持其对害虫的侵染力，对环境友好，是极具开发潜力的介质。

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（责任编辑：杨明丽）