向梅 谢应强 张洪志 李玉艳 王孟卿 臧连生 张礼生

摘要 ：乙酰輔酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase，ACC）是脂肪酸合成第一步反应的限速酶，参与长链脂肪酸的合成。本试验基于七星瓢虫Coccinella septempunctata L.转录组数据，探究ACC在滞育七星瓢虫脂代谢中的调控作用。利用RT-PCR和RACE技术从七星瓢虫中克隆得到ACC基因全长，命名为CsACC（GenBank登录号：MT012819），该基因cDNA序列全长7 217 bp，开放阅读框（ORF）长为6 792 bp，编码2 263个氨基酸，预测蛋白质分子量为255.9 kDa，理论等电点（pI）为5.90，无跨膜螺旋结构，无信号肽。通过氨基酸多序列比对分析，结果显示CsACC与鞘翅目的赤拟谷盗Tribolium castaneum乙酰辅酶A羧化酶同源性较高。利用实时荧光定量PCR技术检测CsACC基因在七星瓢虫正常发育及滞育诱导不同阶段的相对表达量，结果显示，滞育诱导30 d表达量达到最高，滞育诱导60 d、滞育解除期以及正常发育30 d表达量几乎持平。本研究为揭示CsACC基因在脂代谢通路中的调控作用提供理论依据。

关键词 ：七星瓢虫; 乙酰辅酶A羧化酶; 脂代谢; 基因克隆; 表达分析

中图分类号：

S 476.2

文献标识码： A

DOI： 10.16688/j.zwbh.2020093

Cloning and expression analysis of acetyl-CoA carboxylase in

Coccinella septempunctata

XIANG Mei1，2， XIE Yingqiang2， ZHANG Hongzhi2， LI Yuyan2， WANG Mengqing2，

ZANG Liansheng1*， ZHANG Lisheng2*

（1. Jinlin Agricultural University， Changchun 130118， China; 2. Institute of Plant Protection， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Beijing 100193， China）

Abstract

Acetyl-CoA carboxylase （ACC） is a rate-limiting enzyme involved in the first step of fatty acid synthesis. In order to explore the function of ACC in lipid metabolism of Coccinella septempunctata at diapause stage， the full-length cDNA of a ACC gene was cloned using RT-PCR and RACE techniquebased on the transcriptome database. The gene was named CsACC （GenBank accession no. MT012819）. The full length of cDNA sequence of this gene was 7 217 bp and the length of open reading frame （ORF） was 6 792 bp， encoding 2 263 amino acid residues. The predicted molecular weight of the protein was 255.9 kDa with an isoelectric point （pI） of 5.90 without a transmembrane helical structure or signal peptide. The results showed that CsACC had a high homology with that of Tribolium castaneum. The relative expression levels of CsACC gene in different stages of normal and diapause development were detected by real-time fluorescence quantitative PCR. The results showed that the expression levels of CsACC gene reached the highest level on 30th day after diapause induction， and the expression levels were almost flat on 60th day after diapause inductions， 30th day after normal development and after diapause termination. This study provides a theoretical basis for revealing the regulatory role of CsACC gene in the lipid metabolism pathway.

Key words

Coccinella septempunctata; acetyl-CoA carboxylase; lipid metabolism; gene clone; gene expression

七星瓢虫Coccinella septempunctata L.在我国广泛分布，其捕食果树及农作物上的各种蚜虫[12]，是一种典型的捕食性农业害虫天敌，在国内外已被广泛应用[34]。七星瓢虫存在滞育现象，腹部可大量积累脂肪，滞育个体总脂含量较正常发育个体显著增加[5]。根据此现象，本研究通过七星瓢虫转录组数据分析比对正常发育组、滞育组及滞育解除组，筛选得到脂代谢中滞育关联基因，研究差异表达基因，为揭示滞育分子机制提供理论依据[67]。

昆虫脂肪体是维持体内能量平衡的动力来源，也是在变态过程中长时间不进食时脂肪的必要储藏库。大部分营养物质被昆虫吸收后，以甘油三酯（triglyceride， TG）形式储存在体内[8]。而用于合成甘油三酯的脂肪酸（fatty acids， FAs）其合成通路在维持昆虫体内平衡中起重要作用。乙酰辅酶A羧化酶（ACC）是脂肪酸从头合成的限速酶，其催化乙酰辅酶A生成丙二酸单酰辅酶A，最终可以形成C16脂酰辅酶A[910]。ACC可分多亚基型ACC和多功能型ACC。多亚基型ACC存在于植物及细菌中，由4个亚基组成，即生物素羧化酶（biotin carboxylase，BC）、生物素羧基载体蛋白（biotin carboxyl carrier protein， BCCP）及羧基转移酶（carboxyltransferase，CT）的两个亚基α-CT和β-CT。多功能型ACC多存在于真核生物[1112]。ACC已经应用于肥胖、糖尿病以及植物除草剂的药物设计中，也是某些农作物的靶标基因[13]，而在昆虫中研究较少。研究表明，昆虫ACC为单基因编码的多结构域酶，该酶可影响昆虫脂质积累、生殖能力以及表皮功能[14]。研究结果显示，RNA干扰破坏黑腹果蝇Drosophila melanogaster脂肪体中的ACC不影响其生存能力，但会导致甘油三酯储存的急剧减少和糖原积累增加[15]。对埃及伊蚊Aedes aegypti体内ACC和脂肪酸合成酶1（FAS1）进行转录水平定量分析，敲除掉这两种基因后，脂肪体脂质生物合成和中肠消化的速率降低[16]。脂肪酸合成通路关键基因对昆虫的生长、发育和繁殖等都起到了关键作用[17]。在果蝇中发现的脂质代谢基本调节因子为代谢通路的控制提供了新的方向[18]。尖音库蚊Culex pipiens在滞育期间大量的脂肪代谢基因在早期受到抑制，而在滞育解除期高表达[19]，此结果与七星瓢虫脂代谢滞育关联基因表达趋势相似[7]。因此，推测乙酰辅酶A羧化酶在七星瓢虫滞育中也可能发挥作用，并影响滞育进程。本试验对七星瓢虫乙酰辅酶A羧化酶进行全长克隆并分析其功能，利用实时荧光定量PCR技术对滞育和非滞育等阶段雌虫的CsACC进行定量检测，研究其作用及在脂代谢通路中对脂质积累的影响。

1 材料与方法

1.1 供试虫源及处理方法

本试验虫源为中国农业科学院植物保护研究所天敌昆虫组饲养的七星瓢虫室内种群，饲养方法参考王伟等[5]的方法。正常发育饲养条件：温度（24±1）℃、相对湿度（70±10）%、光周期L∥D=16 h∥8 h。滞育诱导饲养条件：温度（18±1）℃、相对湿度（70±10）%、光周期L∥D=10 h∥14h。以正常发育条件下饲养30 d的雌虫为正常发育组。将正常发育条件下得到的初羽化成虫雌雄配对，转移至滞育诱导条件下饲养，饲养40 d且未产卵雌成虫为滞育组。滞育判断方法参考王伟等[5，20]的方法。将滞育成虫转移至正常发育条件下，待其第1次产卵为滞育解除组。

七星瓢虫各处理组收集： 收集新羽化成虫，正常发育30 d，滞育诱导10、20、30 d和60 d雌成虫以及滞育解除组成虫，经蒸馏水洗净后，滤纸干燥，置于液氮速冻，保存于-80℃冰箱。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒RNAiso Plus、RACE试剂盒SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech和qPCR试剂盒SYBRPremix Ex TaqTM Ⅱ （Tli RNase H Plus）均购自TaKaRa公司;反转录试剂盒GlodenstarTM RT6 cDNA Synthesis Kit和PCR扩增试剂盒I-5TM 2×High Fidelity Master Mix购于北京擎科生物科技有限公司。其余试剂均为国产分析纯。

1.3 总RNA提取与cDNA合成

将七星瓢虫样品于预冷研钵内加入液氮研磨至粉末，快速转移至1.5 mL离心管内加入1 mL RNAiso Plus 试剂，按照RNA提取试剂盒说明书提取样品总RNA。利用微量分光光度计（NanoPhotometer P-Class， Implen公司）检测RNA纯度和浓度，记录浓度及OD值，1.5%琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。根据cDNA第一链合成试剂盒说明书合成cDNA，保存于-20℃冰箱。

1.4 CsACC基因的克隆

1.4.1 引物设计及合成

基于七星瓢虫转录组中注释为ACC的基因序列，利用Primer Premier 5.0设计常规PCR引物和实时荧光定量PCR引物，利用DNAMAN设计 3′RACE和5′RACE特异性引物（表1）。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

1.4.2 中间片段PCR扩增、回收纯化及测序

以合成的七星瓢虫cDNA为模板，选取CsACC-f1、CsACC-r1，CsACC-f2、CsACC-r2，CsACC-f3、CsACC-r3，CsACC-f4、CsACC-r4 4对引物进行中间序列扩增。反应体系（50 μL）：Ⅰ-5TM2×High-Fidelity Master Mix 25 μL，ddH2O 20 μL，模板 DNA 1 μL，正、反引物各2 μL，充分混勻，瞬时离心。PCR反应程序：98℃预变性2 min;98℃变性10 s，56℃ 退火10 s，72℃ 延伸15 s，33个循环;72℃ 5 min。利用1.2%琼脂糖凝胶电泳

检测扩增产物，并在紫外灯下切取目的条带按照胶回收试剂盒（Nucleo Spin Gel and PCR Clean-up）说明书进行回收。将回收产物与pClone 007 Blunt simple vector连接，转化至大肠杆菌DH5α，经氨苄青霉素筛选后挑取单个菌落，37℃， 250 r/min培养6 h，将菌液送至上海生工生物技术有限公司测序。

1.4.3 3′ RACE和5′ RACE

按照SMARTerRACE 5′/3′Kit Clontech试剂盒说明书进行3′RACE与 5′ RACE。3′RACE和5′ RACE扩增均采用巢式 PCR。第一轮：反应体系（50 μL），包括 PCR-Grade H2O 15.5 μL， 2×SeqAmp Buffer 25.0 μL， SeqAmp DNA Polymerase 1.0 μL，混匀离心后加入Race-Ready cDNA 2.5 μL，10×UPM 5.0 μL，CsACC-3′GSP1/CsACC-5′GSP1 1.0 μL，混匀离心。反应程序：94℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环;94℃ 30 s，70℃ 30 s，72℃ 3 min，5个循环;94℃ 30 s，68℃ 30 s，72℃ 3 min，25个循环。第二轮：以稀释20倍的第一轮反应产物为模板，按照第一轮反应体系及程序进行巢式PCR，引物为表1中的CsACC-3′GSP2/CsACC-5′GSP2。将最后所得扩增产物纯化回收，根据 In-Fusion HD Cloning Kits（Clontech）试剂盒说明书进行连接转化，挑选单个菌落由上海生工生物技术有限公司测序。

1.4.4 CsACC序列拼接与生物信息学分析

利用DNAMAN对测序结果进行碱基序列拼接及氨基酸序列推导。利用ORF Finder（https：∥www.ncbi.nlm.gov/orffinder/）查找开放阅读框以及推测的氨基酸序列，并确认和DNAMAN的预测一致。利用CDD（http：∥www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/）对其保守结构域进行分析，利用TMHMM Server V.2.0（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/）对跨膜结构进行预测，利用Protparam（https：∥web.expasy.org/protparam/）在线分析氨基酸理化性质，利用SignalP 4.0 Server（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/）进行信号肽预测，利用PredictProtein（https：∥www.predictprotein.org/）和SWISS-MODEL（https：∥swissmodel.expasy.org/）进行蛋白质二级、三级结构预测。在NCBI上对其氨基酸序列进行BLAST比对，利用MEGA 5.0对搜索得到的同源性序列进行系统进化树构建。

1.5 CsACC实时荧光定量 PCR

收集新羽化成虫，正常发育组，滞育诱导10、20、30 d和60 d的雌成虫以及滞育解除组雌成虫共7个处理组，提取RNA，反转录为cDNA用于qPCR反应。利用Light Cycler实时荧光定量PCR仪（Roche， Basel， Switzerland）测定CsACC基因表达量。依据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ（Tli RNase H Plus）试剂盒说明书进行操作。反应体系设为20 μL，包括：2×SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（Tli RNase H Plus） 10 μL，qCsACC-f/qCsACC-r各0.8 μL，cDNA 2 μL，RNase free H2O 6.4 μL。反应条件：95℃ 30 s;95℃ 5 s，60℃ 20 s，40个循环。基因的相对表达量计算采用 2-ΔΔCt法[21]，试验采用3个生物学重复，4个技术重复。

2 结果与分析

2.1 CsACC基因克隆与序列分析

基于七星瓢虫转录组数据，采用RACE 技术克隆得到目的基因全长序列7 217 bp（图1），命名为CsACC（GenBank登录号：MT012819）。分析结果显示，基因开放阅读框（ORF）长6 792 bp（位点93—6 884 nt），编码的蛋白由2 263个氨基酸组成。5′非编码区长92 bp，3′非编码区长333 bp，具polyA尾巴。预测该蛋白分子量为255.9 kD，理论等电点为5.90。无跨膜结构，无信号肽。利用PsortⅡ对蛋白进行亚细胞定位预测，该蛋白出現可能性最高的3处分别为细胞质（52.2%），线粒体（17.4%），细胞核（13%）。在该蛋白的第731—1 474个氨基酸之间存在ACC乙酰辅酶A羧化酶结构域（ACC_central，登录号：pfam08326），该酶参与长链脂肪酸的合成，催化反应过程中的限速步骤。以乙酰辅酶A羧化酶1（SMTL ID：6g2h.1.A）为模型预测CsACC蛋白的3D结构，结果表明，模板与该蛋白的氨基酸序列相似性为63.64%（图2）。

2.2 CsACC基因同源性比对及系统发育树的构建

将七星瓢虫CsACC与8种昆虫的ACC氨基酸序列在GenBank中进行BLAST比对，结果表明，CsACC氨基酸序列在不同物种中同源性较高，相似性达到75.66%（图3）。从NCBI 数据库中选取 20种与该序列同源性较高的物种，利用MEGA 5，通过neighbor-joining（N-J）方法构建CsACC蛋白氨基酸序列在不同昆虫物种间的系统发育树（图4）。根据系统发育树与遗传距离分析结果可知七星瓢虫CsACC蛋白氨基酸序列与赤拟谷盗Tribolium castaneum亲缘关系最近，并与鞘翅目类群同源性较高，与膜翅目、双翅目和半翅目等则聚为一大分支，亲缘关系相差较大。

2.3 CsACC基因的实时荧光定量PCR分析

将七星瓢虫7个处理组进行实时荧光定量分析，以Actin作为内参基因。结果显示，CsACC基因在各阶段均有表达，且表达量有极显著差异（P<0.01）。随着滞育诱导时间的延长，表达量逐渐增加，滞育诱导30 d时达最高水平，滞育诱导60 d、滞育解除期以及正常发育30 d表达量几乎持平，没有显著差异。从图中可明显看出，滞育诱导10、20、30 d的表达量显著高于滞育解除期及正常发育期（图5）。

3 讨论

乙酰辅酶A羧化酶是在代谢过程中催化脂肪酸合成的关键酶，是长链脂肪酸合成的前体，在脂代谢过程中发挥着重要作用。ACC基因目前已经应用于肥胖、糖尿病以及植物除草剂的药物设计中[2224]，但在昆虫滞育相关研究中报道较少。ACC分为异质型和同质型两大类，目前克隆较多的是异质型ACC的亚基基因，如大肠杆菌、分枝杆菌、拟南芥、大豆及棉花等的ACC[14]，另外在鱼类，山羊中研究得比较清楚[25]。有研究报道，干扰黑腹果蝇Dmelanogaster及埃及伊蚊A.aegypti的ACC基因都会导致甘油三酯含量和产卵量下降[1617]。本研究利用 RT-PCR 与 RACE 技术克隆得到的七星瓢虫CsACC全长为7 217 bp，由于PCR技术受到Taq酶和反转录酶的影响，很难一次扩增到7 kb的目的条带，故参照转录组中原始序列设计了4对特异性引物，利用RT-PCR获得该基因全长。其保守区域具有乙酰辅酶A羧化酶结构域，同源性比较结果显示，七星瓢虫CsACC氨基酸序列与赤拟谷盗亲缘关系最近。

昆虫在滞育前会大量储存脂肪，为滞育期生命活动提供能量和水分，滞育期间的营养利用是一个动态过程，被储存的脂肪可与糖、醇互相转化，并调节滞育深度和时间[26]。滞育期间体内脂肪的储存与其抗逆能力也息息相关[2728]。本研究通过实时荧光定量PCR检测到CsACC基因在七星瓢虫滞育诱导期，滞育期和滞育解除期均有表达，滞育诱导30 d达最高，而滞育解除期和正常发育组没有显著差异，此结果与七星瓢虫转录组数据[6]中CsACC变化规律相一致。根据前人研究的七星瓢虫各阶段总脂及甘油三酯含量变化，其在滞育准备期含量均呈上升趋势，并在滞育诱导30 d时含量达到最高，随着滞育时间延长而降低，推测转化为其他物质为机体供能[29]。从生理生化的角度来看，CsACC基因的实时荧光定量PCR结果与七星瓢虫体内甘油三酯的变化规律相符。初步推测，该基因在滞育准备期表达量逐步上升，原因可能是促进脂质大量合成脂肪酸为滞育期做充分准备，也可能是对抗不良环境。滞育诱导60 d及滞育解除期，该基因表达量下降，与正常发育时期一致，可能是让机体恢复至正常水平促进交配产卵等生理功能。在后续试验中，可以利用RNA干扰技术进行该基因的功能验证，进一步对七星瓢虫滞育分子机制进行研究。

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（责任编辑：杨明丽）