吴林生，施洪亮，尚兴荣

合肥师范学院生命科学学院（合肥 230601）

树莓又称山莓、覆盆子、托盘等，是一种多年生落叶灌木果树，其产量高，抗高寒，适应性强，对土壤及环境条件要求低，易于栽培。果实为浆果，柔嫩多汁，风味独特，营养丰富，被赋予“水果之王”“黄金浆果”的美称[1]。树莓果实的营养丰富，其中含有大量的维生素及十几种氨基酸，其中的主要有机酸为柠檬酸和苹果酸[2]。此外树莓含有丰富的Fe、Zn等矿物质元素，还富含花青素、挥发油、花青素、酚酸、萜类等营养成分[3]，还具有预防和缓解心脑血管疾病的功效。树莓可被直接应用于各种食品加工业，如加工成果汁、果酱、果酒及冻干果等，还可被开发应用于医药、美容、染料等多个领域。中国在全球范围内成为树莓产品生产和消费的大国，并且对全球树莓消费市场产生巨大影响[4]。随着树莓的产量不断增加，树莓加工品越来越受消费者青睐，但因为树莓果自身的酸度过高，所以拥有一种能够对树莓酒进行降酸且能够加工出优质树莓酒的方法势在必行。因此，试验充分利用树莓的高营养价值，研究树莓酒的降酸工艺及对其进行优化，得到制备高品质树莓酒的降酸工艺。果酒降酸的方法大多是物理降酸法和化学降酸法，但这2种方法对苹果酸不起作用，而苹果酸在果酒有机酸中含量又较高，除此之外这2种方法对果酒品质的影响也较大。为避免上述问题，采取生物降酸方法——苹果酸-乳酸发酵（MLF）法[5]，通过在树莓酒发酵过程中接种乳酸菌冻干粉，将其中的苹果酸转化为乳酸。

国内对果酒的生物降酸研究起步较晚，但已取得诸多进展，如张春晖等[6]对葡萄酒进行MLF降酸；王治同[7]利用裂殖酵母进行生物降酸，酿造全汁越桔干型酒，降酸效果可观。国内外在果酒的酿造工业上，果酒降酸的方法逐渐从原本的物理、化学降酸法向生物降酸法转变，如可以进行MLF的乳酸菌[8]。关于对果酒进行生物降酸这一方面的研究在国外开展较早，早在18世纪国外就大量生产树莓加工品。在酿造生产红葡萄酒的过程中利用MLF进行生物降酸[9]。该降酸方法是在乳酸菌作用下，以诱导酶也就是苹果酸-乳酸酶的催化作用将树莓酒酒中的L-苹果酸分解为L-乳酸，并释放出CO2过程[10-11]。进行MLF的方法有2种，分别是自然诱导与人工接种[12-13]。自然诱导即提供启动MLF所需要的适宜条件，让反应自发进行，这其中合适的pH、低浓度SO2、适宜的温度为主要因素。但即便提供这些反应条件，MLF的启动也非常困难。所以人工接种乳酸菌的方法成为工业降酸中的常用途径，相比较自然诱导MLF，人工接种诱导MLF克服发酵周期长、发酵不易控制、对环境条件要求高及对酒质可能有负面影响等方面的不足[14]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

红树莓（安徽省蓝莓工程中心）；果酒酵母、果胶酶、乳酸菌冻干粉（上海鼎唐贸易有限公司）；偏重亚硫酸钾（国药集团试剂有限公司）；白砂糖（市售，食品级）。

1.2 仪器与设备

发酵罐（武汉精享达机械设备有限公司）；温度传感器（PT100，杭州晨奕仪器仪表有限公司）；pH传感器（JY-PH2.0，广州佳仪精密仪器有限公司）；糖度传感器（HEEYII，杭州恒仪仪表科技有限公司）；酒精浓度计（AR-120ET，深圳市拓宏达科技有限公司）；声光报警器（HAX-B02485，杭兴智能科技有限公司）；摄像头（1201D-I3，杭州海康威视数字技术股份有限公司）；网络IO控制器（USRIO808，山东有人信息技术有限公司）；云端服务器（ECS-G5，阿里云云计算有限公司）；计算机（天逸510Pro，联想集团有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 树莓酒发酵工艺流程

1.3.1.1 工艺流程

冷冻树莓→解冻→破碎→加入果胶酶→接种酵母菌→调糖→主发酵→皮渣分离→理化指标检测→降酸处理（生物、化学以及物理降酸）→理化指标测定

1.3.1.2 流程要点

原料预处理。常温下将冷冻的树莓解冻，破碎。

果胶酶的添加。添加果胶酶能够提高树莓酒的出汁率，试验果胶酶添加量50 mg/L，并且在30 ℃条件下酶解2 h。

调糖。树莓打浆后，通过蒽酮比色法对其糖浓度进行检测，残糖量应低于4 g/L。

主发酵。26 ℃下发酵5 d。

皮渣分离与澄清。取洗净并且灭菌的纱布（3层），将发酵后的树莓酒连同残渣一起倒入纱布中过滤到新的发酵罐中。

苹果酸-乳酸发酵。树莓酒酸度18.65 g/L、总残糖量9.3 g/L、花青素质量浓度267.29 mg/L、酒精度15.8%vol，添加乳酸菌冻干粉，对树莓酒进行生物降酸。

化学降酸。取300 mL树莓酒样分装至6个三角瓶中备用，分别向其中加入CaCO3、KHCO3、CaCO3·KHCO3联合降酸，K2C4H4O6、KHCO3与K2C4H4O6联合降酸，以及复盐法降酸。重复3次上述步骤，测得的树莓酒酸度前后变化取平均值，以减少误差。

物理降酸。1）低温冷冻法，主要是利用冷冻设备对树莓酒进行降温，使酒体中的酒石酸盐类结晶沉淀，从而达到降酸的目的，通常可以降低酸度0.5～2.0 g/L不等（以酒石酸计）。2）稀释法降酸，采用稀释法降酸对树莓酒进行处理，在每100 mL树莓果汁中分别按不同比例添加白砂糖，用玻璃棒搅拌均匀后监测pH和酸度的变化。

生物降酸。利用微生物分解酸，从而达到降酸目的。降酸微生物根据产物的不同大体可分2种，一是将原有的酸分解成乙醇和二氧化碳，二是将原有的酸分解成更弱的酸和二氧化碳，而被降低的酸主要是苹果酸。

1.3.2 单因素试验及正交试验

选择乳酸菌接种量、降酸温度、降酸时间为树莓酒降酸工艺优化试验的单因素，单因素试验设计见表1，每种因素水平的设计见表2，进行3次平行试验。

表1 单因素试验

表2 正交试验因素及水平设计

1.3.3 理化指标测定方法

树莓酒理化指标检测[15-20]：总酸浓度测定采用酸碱滴定法；残糖量测定采用斐林试剂滴定法；花青素质量浓度测定采用pH示差法；酒精度测定采用酒精计法。

感官评价：随机选取20名学生（男女各10名）通过眼、口、鼻等感觉器官对试验中酿造的树莓酒中进行感官评价，主要针对树莓酒的色泽、香气、滋味及其典型风味等方面进行评价，设定评定满分100分，具体标准见表3。

表3 树莓酒感官评分标准

2 结果与分析

2.1 MLF（苹果酸-乳酸发酵）降酸单因素试验结果与分析

2.1.1 不同乳酸菌接种量的试验结果

乳酸菌接种量6%，降酸温度22 ℃时，根据不同的降酸时间，各理化指标的变化如表4和图1所示。分析可得，乳酸菌接种量在4%～8%内逐渐增大时，树莓酒酸度会随之逐渐降低，乳酸菌接种量8%时，树莓果酒的酸度达最小值11.6 g/L；但乳酸菌接种量大于8%时，树莓酒酸度会随之增加而升高，可能是因为乳酸菌接种量过高，对苹果酸-乳酸的转换起到负反馈作用，挥发酸含量减小，降酸效果反而较差；故乳酸菌接种量8%时，其对树莓酒的降酸效果最好；乳酸菌接种量10%时，树莓果酒的色泽红艳，口感香醇，酒香味浓且酒体稳定；乳酸菌接种量对残糖量、酒精度及花青素含量的影响较小。

表4 不同乳酸菌接种量对残糖量、酒精度、感官评价及花青素的影响

图1 乳酸菌接种量对酸度的影响

2.1.2 不同降酸时间的试验结果

乳酸菌接种量6%、降酸温度22 ℃时，根据不同的降酸时间，各理化指标的变化如表5和图2所示。分析可得，降酸时间2～5 d时，随着降酸时间增加，酸度会随之降低，降酸时间5 d时，酸度达最小值12.7 g/L；但降酸时间大于5 d时，酸度会随之增加而升高，可能是因为降酸时间增大后，一部分乳酸又转化成苹果酸；故降酸时间5 d时，降酸效果最好；降酸时间5 d时，果酒的色泽红艳，口感香醇，酒香味浓且酒体稳定，可能因为酸度最低且色泽香气都较佳；残糖量会随着降酸时间增加逐渐降低最终趋于4 g/L，相应的酒精度随之增加，最终趋于12.5%vol；花青素质量浓度也会随着降酸时间增长而逐渐降低。

表5 不同降酸时间对残糖量、酒精度、感官评价及花青素的影响

图2 降酸时间对酸度的影响

2.1.3 不同温度的试验结果

降酸时间4 d、乳酸菌接种量6%时，随着温度的不同，各理化指标的变化如表6和图3所示。分析可得，降酸温度18～24 ℃时，酸度会随着降酸温度增加而逐渐降低，降酸温度24 ℃时，果酒的酸度达最小值12.8 g/L，降酸温度大于24 ℃时，酸度会随之增加而升高，可能是温度过高时，其对苹果酸-乳酸的转换存在影响，使得降酸效果变差。故降酸温度24 ℃时，降酸效果最佳，果酒的色泽红艳，口感香醇，酒香味浓且酒体稳定；残糖量会随着降酸温度的上升而逐渐降低并最终趋于4 g/L，酒精度则大约稳定在12%vol；花青素质量浓度则会随着降酸温度增加而逐渐降低，降低趋势较为缓慢。

表6 降酸温度对残糖量、酒精度、感官评价及花青素的影响

图3 降酸温度对酸度的影响

2.2 MLF（苹果酸-乳酸发酵法）正交试验结果与分析

表9 方差分析表

由表7和表8可得，RB＞RC＞RA；FB＞F0.05，则p＜0.05，说明降酸时间对树莓酒的色泽、口感以及品质的影响达到显著水平；FC＞F0.1，则p＞0.1，说明乳酸菌接种量对树莓酒的色泽、口感及品质有一定影响。因此，在各个影响因素中对树莓酒色泽、口感及品质的影响程度依次是降酸时间、乳酸菌接种量、降酸温度，这与正交试验分析的结果一致。

表7 正交试验水平

表8 正交试验结果

3 结论与讨论

通过化学降酸法、物理降酸法和生物降酸法3种降酸方法，考察这3种方法对干红树莓酒理化指标（糖度、酸度、酒精度、干浸出物）、色度、香气、口感及稳定性的影响，筛选出适合干红树莓酒最佳降酸方法及最优降酸工艺。在对其进行生物降酸，采取生物降酸法——苹果酸-乳酸发酵（MLF）法，降酸菌种为乳酸菌，通过在树莓酒发酵过程中接种乳酸菌冻干粉，将其中的苹果酸转化为乳酸，分别研究乳酸菌接种量、降酸时间及降酸温度3个因素对树莓干酒进行生物降酸的影响，以所得树莓干酒对比原始树莓干酒的酸度、残糖量、酒精度、花青素含量及对二者的色泽、气味及滋味进行感官评价。通过试验研究优化树莓酒降酸工艺，结果发现最佳的降酸条件为乳酸菌接种量8%、降酸温度24 ℃、降酸时间5 d。所得树莓酒酸度11.6 g/L，残糖量4.4 g/L，酒精度11.2%vol，花青素质量浓度165.22 mg/L，呈玫瑰红色，口感香醇，酒香味浓且酒体稳定。

在生物降酸的过程中，仍存在有待解决的问题，如采用先发酵后降酸的方法，虽然能够得到更好的降酸效果和精准数据，但对树莓酒的品质有一些影响；如果采用先降酸后发酵的方法，在一定程度上可以提高树莓酒质量，但因为其在空气中长时间暴露，可能会造成酒体被污染，对树莓酒各项理化指标的分析存在一定影响。上述问题有待后续深入研究加以解决。