黄佳丽 陈臻瑶 雷天瑶 王朝霞 程志祥

南京医科大学第二附属医院肿瘤医学中心，江苏南京 210011

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对全世界人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一[1]，约70%的肺癌为非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）[2]。NSCLC 最常见的驱动基因是表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）[3]，以这一驱动基因为靶点的表皮生长因子受体酪氨酸酶抑制剂（epidermal growth factor receptor tyrosine kinase inhibitor，EGFR-TKI），在临床上取得了肯定的疗效。然而，无论第1 代或第2 代EGFR-TKI，8～12 个月后，多数患者最终都获得了耐药性[4]，最主要的耐药机制就是T790M突变[5]。为此，研究人员开发了针对T790M 突变的第3 代EGFR-TKI——奥希替尼，然而奥希替尼的获得性耐药仍不可避免的出现。EGFR-TKI 的获得性耐药是目前治疗EGFR 突变NSCLC 面对的巨大难题，因此，克服EGFR-TKI 的获得性耐药尤为重要。本研究使用NSCLC 细胞株HCC827，通过浓度递增法构建奥希替尼耐药细胞株HCC827OR，并探讨其耐药机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 细胞株 HCC827 购自中科院细胞库，HCC827OR细胞株由程志祥和王朝霞课题组构建。

1.1.2 药品与试剂 奥希替尼（HY-15772）购于MCE 公司；RPMI-1640（61870036）、FBS（16140071）、胰酶（25 200072）购于Gibco 公司；CCK8（K1018）购于APExBIO公司；兔 抗人EGFR（4267S）、p-EGFR（2220S）、AKT（9272S）、p-AKT（9611S）、ERK（4695S）、p-ERK（4370S）、E-cadherin（3195S）和Vimentin（5741S）购于CST 公司；鼠抗人GAPDH（HRP-60004）购于Proteintech 公司；上述抗体的稀释比例为1∶1000。

1.2 实验方法

1.2.1 耐药细胞株的建立 初始，给予10 nmol/L 奥希替尼处理细胞。初筛时，按10 nmol/L 的浓度差提升，直至细胞稳定；浓度提升至亲本细胞半抑制浓度（IC50）的10 倍时按100 nmol/L 的浓度差提升；直至细胞能在2 μmol/L 的含药培养基中稳定生长。

1.2.2 细胞对药物敏感性的检测 细胞经奥希替尼孵育72 h，CCK8 孵育2 h，酶标仪（BioTek，ELx800）检测吸光度（OD）值。计算IC50及RI。抑制率=[（对照组OD 值-实验组OD 值）/（对照组OD 值-空白组OD 值）]×100%，RI=IC50（耐药细胞）/IC50（亲本细胞）。

1.2.3 细胞增殖实验 细胞于96 孔板培养0、1、2、3、4 d，CCK8 孵育2 h，检测OD 值，计算细胞倍增时间（DT），DT=t×[lg2/（lgNt-lgNo）]。细胞于6 孔板培养约2 周，甲醇固定结晶紫染色。EdU 培养基培养细胞2 h，固定染色。

1.2.4 流式细胞实验 细胞1000 r/min 离心5 min（离心半径10 cm），PBS 清洗，FITC-Annexin V 和PI 双重染色，分析。

1.2.5 Western blot 分析细胞中相关蛋白 细胞加入不同浓度奥希替尼处理4 h，提取蛋白，10%SDSPAGE 胶分离蛋白，转膜，封闭，抗体孵育，化学发光显影。

1.3 统计学方法

运用GraphPad 8.0 对数据进行分析作图，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t 检验。以P ＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 耐药细胞株的建立及耐药性检测

同过药物浓度递增的方法，历时10 个月，体外成功构建了HCC827OR。CCK8 结果显示，HCC827 的IC50为（15.07±0.43）nmol/L，HCC827OR 的IC50为（6.64±0.10）μmol/L，RI 为440.31。见图1。

图1 HCC827 和HCC827OR 的奥希替尼浓度-细胞抑制率曲线

2.2 HCC827 和HCC827OR 的形态学变化

在形态上，与HCC827 比较，HCC827OR 细胞轮廓明显且表现出间充质样表型，包括梭形的外观，细胞间的连接丧失和极性，部分细胞有片状伪足伸出。见图2。

图2 HCC827 和HCC827OR 的形态学变化（100×）

2.3 HCC827 和HCC827OR 的细胞增殖能力差异

CCK8 增殖实验中，第1 天，HCC827OR 的细胞活性高于HCC827（t=2.583，P ＜0.05），第2、3、4 天，HCC827OR 的细胞活性显著高于HCC827（t=5.539、5.755、7.843，P ＜0.01）。HCC827OR 集落形成较HCC827增多（t=8.223，P ＜0.01）。见图3。HCC827 和HCC827OR的倍增时间为（49.30±5.42）h 和（34.26±1.66）h。EdU结果显示，HCC827OR 细胞EdU 染色阳性率高于HCC827（t=5.548，P ＜0.01）。见图4（封三）。

图3 HCC827 和HCC827OR 细胞增殖能力差异

2.4 HCC827 和HCC827OR 细胞凋亡差异

HCC827OR 的凋亡率低于HCC827（t=5.606，P ＜0.01），提示HCC827OR 的凋亡能力减弱。为进一步验证，分别给予15 nmol/L 奥希替尼处理，结果显示，HCC827 凋亡明显增加（t=11.48，P ＜0.01），而HCC827OR凋亡差异无统计学意义（t=0.868，P ＞0.05）。见图5。

图5 HCC827 和HCC827OR 细胞凋亡

2.5 HCC827 和HCC827OR 细胞蛋白质表达差异

与HCC827 比 较，HCC827OR 的EGFR 和p-EGFR 表达下降（P ＜0.05），p-AKT 和Vimentin 表达上升（P ＜0.05）。两株细胞p-EGFR、p-AKT 和p-ERK的表达随着奥希替尼浓度的上升而下降（P ＜0.05）。见图6。

图6 HCC827 和HCC827OR 细胞中相关蛋白表达

3 讨论

第三代选择性EGFR-TKI——奥希替尼，在临床上取得了重大效益。尽管奥希替尼的良好效果为治愈肺癌带来了巨大希望，但获得性耐药的患者会产生[6]。研究显示，奥希替尼获得性耐药的机制可概括如下几点。①基因改变：继发性突变[7-9]，基因融合[10-11]，基因重排[12-13]及基因扩增[14-15]；②信号通路改变[16-18]；③表型改变[19-22]；④其他相关机制：EGFR 膜/质/核移位[23]，自噬增加[24]。此外，尼古丁也参与奥希替尼的耐药[25]。

本研究耐药细胞诱导时间为10 个月，接近于奥希替尼临床耐药出现的时间[1]，将更能从体外的角度探讨奥希替尼耐药的机制。与亲本细胞比较，HCC827OR对奥希替尼高度耐受，具有间充质样表型，较强的增殖能力，凋亡能力减弱。此外，其与细胞生长相关的信号通路蛋白的表达存在差异。值得注意的是，HCC827OR 细胞的p-AKT 和p-ERK 的药物作用效果没有HCC827 细胞明显，进一步提示HCC827OR对奥希替尼不敏感。HCC827OR 细胞Vimentin 的表达上调，提示HCC827OR 细胞呈上皮-间充质转化。

综上所述，本研究构建并鉴定了奥希替尼耐药细胞株HCC827OR，为后期对其耐药机制的深度研究提供了研究基础。