汪丽娜，赖发英，周春火，尹 鑫

(江西农业大学 国土资源与环境学院，江西 南昌 330045)

1 引言

土壤中含有种类丰富且数量巨大的微生物，这些微生物不仅仅是土壤物质转化和养分循环的推动者，还是土壤中植物有效养分的储备库，对植物生长、气候调节等生态功能起着不可替代的重要作用[1]，所以土壤微生物受到的关注日益增加。而稻田是最大的人工湿地生态系统，稻田土壤中微生物对调节土壤营养物质的循环，维持土壤肥力具有重要意义。东乡野生稻(Oryza rufipogon)是在1979年首次报道发现的[2]，是我国三大野生稻之一，具有抗病虫、抗旱、抗寒等特性[3～5]，是国家二级保护植物。迄今，人们对东乡野生稻进行了广泛的研究，但多是以野生稻为个体研究[3～7]，而基于16S rDNA基因高通量测序对东乡野生稻中土壤微生物研究较少。

本文选取东乡野生稻的3个不同生境点以及一个对照点的土壤作为研究对象，分别对土壤基于16S rDNA基因 V3-V4 可变区和功能基因的进行高通量测序，对不同生境点与栽培稻土壤中细菌群落结构及多样性，以及各样点中固氮菌的群落结构分布进行分析，进一步探究东乡野生稻与栽培稻中土壤微生物群落多样性差异性及与环境因子的相关性。

2 材料与方法

2.1 试验方案

本研究供试土壤取自江西省东乡县东乡野生稻原位保护区内，采样深度为0～20 cm。三个保护区共设置3个采样点以及一个栽培稻对照点位(Contrast)，其中俺家山原生境点 (DY 1)；马池塘原生境点设置一个采样点(DY 2)；水桃树下原生境保护点设置一个采样点(DY 3)。取样时间为2019年11月，每个点位取0-20cm土层的混合土样。土壤样品分别置于标记好的无菌自封袋内排尽空气，在低温保温箱中放置，并在 24 h内带回实验室处理并保存。将部分样品-20 ℃保存供分子生物学分析， 剩余样品保存于 4 ℃以供后续理化性质分析。

有效磷采用0.5 mol/L NaHCO3法，碱解氮采用碱解扩散法，全氮采用半微量开氏法，速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法每个样品设置 3 个平行，上述测定方法见参考文献[8]。

2.2 基于16S rDNA和功能基因的微生物群落结构分析

使用E.Z.N.A.®Soil DNA Kit 试剂盒提取DNA，并用 2% 琼脂糖凝胶电泳检测DNA，引物序列如表1所示，由杭州联川生物技术股份有限公司(下文简称“联川生物” )对基因进行测序。基于功能基因的高通量测序与普通的16S rDNA 测序方法相似，只是测序前期需要针对目标功能基因收集相应的序列信息， 再针对目标基因设计通用扩增引物。 本研究固氮菌使用的功能基因为固氮酶铁蛋白nifH。

表1 实验中涉及到主要引物

3 结果与分析

3.1 土壤理化性质分析

从表2可以看出，东乡野生稻田土壤中样品DY2的含量高于DY1、DY3的含量；而对照组CK有效磷明显高于野生稻田土壤。野生稻田土壤中速效钾含量DY1的含量高于DY2、DY3；而对照组含量明显高于野生稻。样品全氮含量中样品DY2的含量高于DY1、DY3的含量；而对照组CK明显高于野生稻田土壤。野生稻田土壤中碱解氮含量中DY1含量最小，对照组碱解氮含量低于野生稻。除碱解氮外，对照组土壤理化指标均高于东乡野生稻原生境土壤。

表2 土壤理化性质

3.2 土壤细菌Alpha多样性指数

利用基于16S r DNA基因的高通量技术，对3个东乡野生稻的稻田土壤以及对照组栽培稻的土壤样品以97%的序列相似度作为分类阈值，共获得275 176条16S rDNA V3-V4序列，有效序列聚类后共获得7957个OUT。测序数据大于Q20%的平均有效率为96.35%(±0.05)，大于Q30%为90.32%(±1.08)，测序数据的有效率均高于90%，这表明测序数据较好且可靠。各土壤样品的覆盖率均为1.00，能够反映出各水稻田土壤中微生物群落结构的真实情况(表3)。东乡野生稻原生境土壤(DY)中Shannon指数及Chao1指数均高于栽培稻(Contrast)，其中点位DY1的指数差异最为明显，这表明东乡野生稻土壤中微生物多样性高于栽培稻土壤。

表3 土壤微生物群落Alpha多样性分析

3.3 土壤细菌群落结构分析

为了解东乡野生稻与栽培稻两种类型土壤微生物群落结构的差异，对聚类后的OTU序列进行注释，4个水稻田土壤样品中细菌OTU属于61门157纲326目495科742属。将相对丰度排名低于30的以及在该水平上没有注释结果的细菌归为Others。在门水平上各土壤样品优势细菌均为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)，总相对平均丰度达到61.85%左右，且不同区域的稻田土壤存在较大的差异(图1)，特别是在东乡野生稻(DY)与栽培稻(Contrast)土壤之间差异更加明显。由图1可知不同区域的野生稻稻田土的微生物群落组成不相同，左侧为Bray-Curtis距离聚类树结构，样品聚类越近，分支越短，表明样品组成越相似。DY1与DY2细菌群落组成相似，变形菌门相对丰度最大，分别为36.82%、31.11%，其次为放线菌门(19.13%、14.56%)和绿弯菌门(10.21%、10.46%)。而虽然DY3与Contrast在同一分支上，但其样品组成相似度相对较低，DY3点位以放线菌门相对丰度最高为34.29%，其次为变形菌门(28.71%)，再者是绿弯菌门(10.31%)和酸杆菌门(Actinobacteria,9.37%)。栽培稻土壤中酸杆菌门(Actinobacteria,13.85%)明显高于野生稻中相对丰度。Latescibacteria(0.06%～1.93%) 、Omnitrophicaeota(0.01%～1.56%)和BRC1(0.01%～0.26%)为东乡野生稻原生境土壤中特有细菌门；Candidatus-Adlerbacteria(0.32%)和 Tenericutes(0.005%)为栽培稻特有的细菌门。

属水平的细菌相对丰度结果如图2所示，Subgroup-18-unclassified(3.39%)、Bacteroidetes-vadinHA17-unclassified(3.22%)、Spirochaeta-2(2.97%)、Sva0485-unclassified(2.94%)和Syntrophaceae-unclassified(2.91%)是DY1水稻田土壤细菌优势属；DY2的土壤细菌优势属分别是Sva0485-unclassified(5.42%)，Aminicenantales-unclassified(5.13%)，Subgroup-18-unclassified(4.46%)，Syntrophaceae-unclassified(3.30%)，Thermodesulfovibrionia-unclassified(3.11%)；DY3的为Acidobacteriales-unclassified(10.00%)、Subgroup-2-unclassified(6.54%)、Candidatus-Koribacter(5.86%)、WPS-2-unclassified(5.29%)、Candidatus-Solibacter(3.84%)。而Contrast土壤中细菌优势属为Acidobacteria-unclassified(5.16%)、KD4-96-unclassified(3.05%)、Gemmatimonas(4.00%)、Ktedonobacterales-unclassified(3.58%)和Saccharimonadales-unclassified(3.40%)。

3.4 土壤固氮菌群落结构分析

通过基于功能基因的高通量测序，其有效数据中数据质量≥Q20的数据比例为94.90%～96.33%，数据质量≥Q30的数据比例为84.52%～88.51%，表明此次测序数据较好且可靠。observed-species、chao1指数高，说明样品物种数目多；shannon、simpson指数高，说明物种丰度以及均匀度都很高，由表3可知，DY组无论从固氮菌物种数目还是物种丰度和均匀度来说都高于Contrast组，这表明东乡野生稻田土壤中固氮菌的群落多样性和丰度均高于栽培稻土壤中的。此次测序unclassified占比较大(79.00%～84.34%)，四个样品共有三门，变形菌门(Proteobacteria)为优势门四个样点均有，相对丰度为14.53%～21.00%，其中DY3含量最高，占21%；绿菌门(Chlorobi)只有DY1(1.13%)和DY2(0.22%)有，而蓝藻细菌门(Cyanobacteria)只有DY3(0.01%)和Contrast(0.03%)。不同样点的优势属不尽相同，其中DY1的优势属为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,7.47%)、Pseudacidovorax(1.81%)、绿棒菌属(Chlorobaculum,1.13%)，DY2的优势属为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,13.66%)、固氮螺菌属(Azospira,1.80%)、Pseudacidovorax(1.01%)；DY3的优势属为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,18.26%)、甲基孢囊菌属(Methylocystis,0.69%)、红长命菌属(Rubrivivax,0.60%)；Contrast的优势属为慢生根瘤菌(Bradyrhizobium,7.44%)、甲基球菌属(Methylococcus,3.30%)、红长命菌属(Rubrivivax,3.30%)。Contrast存在两种特有菌属，为根瘤菌属(Azorhizobium,0.11%)、微鞘藻属(Microcoleus,0.03%)。

图1 不同区域稻田土壤细菌群落结构特征及Bray-Curtis距离聚类树(门水平，前30)

图2 不同区域稻田土壤细菌群落结构特征(属水平，前30)

3.5 环境因子对水稻土微生物结果的影响

使用冗余分析(redundancy analysis，简称RDA)分析部分的环境因子对四个水稻田土壤样品的关系。图3为土壤样品在属水平的前十个属与环境因子(速效磷、速效钾、碱解氮)的关系分析。由图3的横纵轴线分别可解释总变化70.15%和27.57%，这表明此次所选的环境因子可以较好的揭示对细菌群落的影响，四个样品在四个不同象限，这表明四个样品间细菌群落结构差异显著。环境因子箭头越长说明对细菌群落的影响越大，夹角越小说明其相关性越大[11～13]。速效磷和速效钾与Candidatus-Koribacter、KD4-96-unclassified、Acidobacteria-unclassified、Candidatus-Solibacter呈正相关，而与Acidobacteriales-unclassified、Subgroup-2-unclassified、ADurb.Bin063-1、Sva0485_unclassified、Aminicenantales-unclassified、Subgroup-18-unclassified呈负相关；碱解氮与Candidatus-Koribacter、Candidatus-Solibacter、Aminicenantales-unclassified、Subgroup-2-unclassified、KD4-96-unclassified、ADurb.Bin063-1呈正相关，而与Acidobacteria-unclassified、Acidobacteriales-unclassified、Sva0485_unclassified、Subgroup-18-unclassified呈负相关。由图4的横纵轴线分别可解释总变化50.3%和38.17%，这表明此次所选的环境因子可以较好的揭示对固氮菌群落的影响，图4为固氮菌前10个属与环境因子(速效磷、碱解氮、全氮)之间的RDA分析，速效磷与甲基球菌属、红长命菌属、Pseudacidovorax、Paraburkholderia呈正相关，全氮与甲基球菌属、红长命菌属、Paraburkholderia、甲基孢囊菌属和慢生根瘤菌呈正相关，碱解氮与Paraburkholderia、甲基孢囊菌属和慢生根瘤菌呈正相关。

图3 环境因子与细菌群落结构RDA分析

图4 环境因子与固氮菌群落结构RDA分析

4 结论与讨论

近年来，有许多学者对野生稻的根系微生物群落组成进行研究，但对于野生稻原生境土壤微生物群落组成却鲜有研究，本研究使用基于16S rDNA基因和功能基因的高通量测序手段对东乡野生稻原生境土壤与栽培稻土壤中细菌和固氮菌的群落结构进行比较，揭示其之间是否具有差异。对土壤中氮磷钾等营养物质而言，本研究表明东乡野生稻田中除碱解氮外，速效磷、速效钾和全氮含量均显著小于栽培稻田，这和东乡野生稻田中未施用肥料的结果是相吻合的，但与程宁宁等[14]对海南野生稻的养分状况有所不同，这与两地气候与土壤的差异性有关；且不同区域的东乡野生稻田土壤的氮磷钾含量差别较大。对于土壤中细菌群落结构组成，东乡野生稻原生境土壤与栽培稻土壤样品中细菌OTU属于61门157纲326目495科742属，从土壤细菌的Alpha多样性指数来看，东乡野生稻原生境土壤中细菌多样性指数和均匀度高于栽培稻土壤，Bulgarelli等[15]的研究证实了野生大麦根部细菌的多样性显著高于对照组，在戴菲[16]的研究中表明在冬季低温季节东乡野生稻根际土壤微生物总量略高于对照组的栽培稻土壤，这与我们采样季节相符合。

东乡野生稻原生境土壤与栽培稻土壤之间细菌群落结构组成差异明显，且不同区域的野生稻原生境土壤中群落组成也不尽相同。在此次研究野生稻与栽培稻优势菌门均为为变形菌门、放线菌门和绿弯菌门，但栽培稻的酸杆菌门相对丰度明显高于东乡野生稻土壤。在野生稻原生境土壤和栽培稻土壤中均存在特有的菌门，如Latescibacteria(0.06%～1.93%) 、Omnitrophicaeota(0.01%～1.56%)和BRC1(0.01%～0.26%)为东乡野生稻原生境土壤中特有细菌门；Candidatus-Adlerbacteria(0.32%)和 Tenericutes(0.005%)为栽培稻特有的细菌门。而对于属野生稻土壤和栽培稻中特有的属分别有35个和104个。通过RDA分析可知，速效钾、速效磷和碱解氮对土壤细菌群落影响显著，与细菌属的前十个属相关性不同。对于固氮菌来说，从Shannon指数来看，东乡野生稻土壤中固氮菌微生物多样性高于栽培稻的。目前，查询和鉴定固氮酶铁蛋白nifH基因序列主要是NCBI数据库(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)。但由于世界范围内却反相关基础研究数据的信息，有些情况得到的查询结果为unclassified。此次研究中unclassified平均相对丰度占比为81.67%。此外，东乡野生稻土壤中固氮菌的优势属为慢生根瘤菌、Pseudacidovorax和固氮螺菌属，而栽培稻的优势属为慢生根瘤菌、甲基球菌属和红长命菌属，且在栽培稻中存在两种特有的根瘤菌属和微鞘藻属。由RDA分析可知，速效磷、碱解氮和全氮是影响土壤中固氮菌群落的主要影响因子。

总的来说，东乡野生稻原生境土壤中氮磷钾营养物质，除碱解氮外，均高于栽培稻土壤中的含量；野生稻原生境土壤中细菌多样性和固氮菌多样性均大于栽培稻土壤，而其中共有优势菌门和优势菌属较多，独有的优势菌属较少。东乡野生稻原生境土壤中细菌优势门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acidobacteria)和绿弯菌门(Chloroflexi)。栽培稻土壤中优势门为变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Acidobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)和酸杆菌门(Actinobacteria)。东乡野生稻土壤中固氮菌的优势属为慢生根瘤菌、Pseudacidovorax和固氮螺菌属，而栽培稻的优势属为慢生根瘤菌、甲基球菌属和红长命菌属。由RDA分析可知，碱解氮、速效磷和速效钾是影响土壤细菌群落结构的主要影响因子，碱解氮、速效磷和全氮是影响土壤固氮菌细菌群落结构的主要影响因子。