王广成，王绍平，邵 锐 ，贾亚文，杨 程，王丽行，潘 鑫

(1．安徽马钢矿业资源集团南山矿业有限责任公司，安徽 马鞍山 243000；2．合肥工业大学 资源与环境工程学院，安徽 合肥 230009；3．中钢集团马鞍山矿山研究总院股份有限公司，安徽 马鞍山 243000)

1 引言

酸性矿山废水(Acid mine drainage，AMD)是矿山开采过程中/开才结束后金属硫化矿物(如黄铜矿、黄铁矿)长期暴露于露天环境，在微生物驱动下，经大气、水共同作用发生的氧化性溶解形成的酸性废水，是世界上普遍的环境问题[1，2]。其典型特征为低pH(一般pH<3)，含有高浓度溶解性有毒金属离子(Fe、Mg、Mn、Al等)和高浓度硫酸盐[1～3]。未经处理的酸性矿山废水若直接排放到环境中会污染周边水生、陆生环境，抑制动植物生长甚至危害人类健康[4]。由于危害性大，成份复杂，处理难度高，AMD长期受到广泛的关注研究。

作为典型的极端生态环，AMD中的微生物群落结构特征一直是研究的热点领域[5～8]。极端微生物对于AMD的形成，演化与修复过程至关重要，如Acidithiobacillusferrooxidans能加速矿物的氧化溶解、水体酸化过程，是促进AMD形成的最普遍的菌种之一[9]。硫酸盐还原菌是目前AMD生物反应器中最常用的功能菌属，具有广泛的应用前景[10～12]。因此，关注极端环境中的微生物种类对于AMD的源头生态治理和末端治理至关重要。为全面了解酸性矿山废水的水质和微生物结构的空间分布特征，本研究从某安徽省某酸水库采集了不同水深的样品进行了理化指标的表征和微生物群落的分析。

2 材料与方法

2.1 采样位点及样本采集

采样点为安徽省马鞍山市某矿山开采结束后遗留矿坑形成的酸水库，该水库面积约为0.1268 km2。本研究为全面监测酸水库的动态变化和了解嗜酸微生物在不同水深空间处的分布情况，采集了不同深度梯度(水下0.5 m、5 m、10 m、15 m)的水样和微生物样品。水样采用有机玻璃采样器进行采集并使用500 mL干净的聚乙烯采样瓶分装储存；生物样品利用0.22 μm混合纤维素脂滤膜富集。所有样品于4 ℃低温冷藏保存运至实验室测量相关理化指标。

2.2 理化指标测定

每个位点的温度(T，temperature)、pH值、溶解氧(DO，dissolved oxygen)、氧化还原电位(ORP，redox potential)利用六位参数仪进行现场测定。经预处理低温冷藏保存的水样过膜后采用TOC仪(耶拿multi N/C 3000，德国)测定TN、DOC、DIC含量；磷酸盐和总磷采用钼酸铵光谱法测定；氨氮浓度通过纳氏试剂分光光度发获得；Fe(Ⅱ)采用邻菲罗啉分光光度法测定；硫酸盐用离子色谱法(戴安 ICS-900，美国)进行测定；溶解性重金属离子Cu、Zn、Mn、Mg、Ca等采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)进行测定。

2.3 DNA提取，PCR扩增和高通量测序

所有样品DNA采用FastDNA Spin Kit for Soil (MP Biomedical)试剂盒进行提取，用微量分光光度计测定DNA浓度。原核生物利用通用引物F515和R806扩增细菌。样品送往广州美格公司进微生物测序。

3 结果和讨论

3.1 非金属理化指标的垂向分布

结果表水和下层水各理化指标均存在差异，相同水深的水样差异较小(图1)。酸水库表水温度为17.0～17.2 ℃，下层水温度为16.6～17.0 ℃，表水高于下层水并且随着深度的增加，温度逐渐降低，光照时间的长短和光照强度对水体温度影响最大。表水pH值为3.33～3.46，下层水为3.51～3.69，表水pH值相对较低，随着深度增加，pH值逐渐升高。此外，表水的溶解氧和氧化还原电位相对较高，下层水随着深度增加溶解氧浓度和氧化还原电位降低。总体上，酸水库呈现出明显的水质分层。表水层为氧化环境，pH值更低，这可能是由于以下三个原因：①酸水库周边堆放的尾矿(以硫铁矿为主)在水和大气的共同作用下产生酸水并向酸水库表水输入[13]；②酸水库表水亚铁氧化为三价铁后水解产酸：Fe3++H2O-—Fe(OH)3(s)+3H+；③次生矿物(主要为黄钾铁矾和施氏矿物等)的形成过程也会产生氢离子。表水中氮磷等营养元素的含量更少，可能是由于藻类的繁殖吸收了大量营养元素[14]。此外，藻类死亡后沉积至酸水库底部，其生物质被微生物降解，从而在下水层释放更多的营养物质。

图1 酸水库中物理性指标的垂向变化

3.2 金属离子浓度的垂向分布

酸水库表水与下层水存在较大差异(图2)。除了钙离子和铜离子，其他金属离子基本表现为表水浓度远小于下层水。表水中亚铁和总铁浓度分别为1.6～2.4 mg/L和98.4～119.1 mg/L，相对于下层浓度326.2～442.9 mg/L和355.4～586.0 mg/L较低，并且二价铁在表水中占的比例较小，说明水体中铁离子主要以三价铁及其他形式存在。水体无机营养盐充足，表水中的藻类微生物生长较好，使得表水溶解氧维持在较高浓度，加速了亚铁离子的氧化，三价铁在水中发生水解等一系列反应，导致亚铁离子浓度远小于下层水体。同时，该水体中含有大量硫酸根等，可促进铁离子形成施氏矿物等，向下沉降或吸附于岸边，使得表水中铁离子浓度小于下层水。表水中的锰、镁、铝、锌离子浓度分别为348.0～420.3 mg/L、2447.0～3184.0 mg/L、759.6～796.0 mg/L、18.2～22.2 mg/L低于下层水的浓度为669.5～852.5mg/L、4931.0～7036.0 mg/L、920.6～1169.0 mg/L、30.0～41.6 mg/L。这些金属离子可能被水体中形成的施氏矿物等聚集体吸附，向下层水沉降[15]。另外，酸水库表面存在丰富的微生物，经过长期驯化，已经适应低pH、高金属离子浓度的环境，这些微生物可以通过自身分泌出的有机物上的阴离子官能团与金属阳离子结合从而对金属离子进行富集，并且随着微生物消亡逐渐向下层累积。

图2 酸水库中金属离子浓度的垂向变化

3.3 原核细菌的微生物分布

原核微生物测定结果如图3所示。酸水库中的微生物群落存在显著分层特征，主要分为好氧异养的表层微生物和下层耐受性强的微生物。其中表水主要为变形菌门(Proteobacteria)，放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)的微生物，相对丰度分别为68.9%，24.7%，3.6%。这些微生物是水体酸化的主要承担者，能促进硫铁矿物的氧化溶解过程，释放H+，金属阳离子和硫酸盐，以铁和/或硫氧化菌属，铁还原菌属，碳循环代谢菌属为主[6，7]。下层水主要为厚壁菌门(Firmicutes)，变形菌门(Proteobacteria)，放线菌门(Actinobacteria)和酸杆菌门(Acidobacteria)，相对丰度依次分别为34.5%～58.0%，23.7%～49.3%，4.3%～4.9%，4.5%～6.4%。原本在表水占据优势的酸杆菌门和放线菌门在此处丰度显著降低，该区域微生物数量有所降低，但多样性有着极大的提高。下层水中的厚壁菌门丰度迅速增加，其主要成员为梭菌纲和杆菌纲生物，梭菌纲中的微生物大多能通过发酵呼吸进行有机质降解，但由于嗜酸性的梭菌研究相对较少，水库中大多为未鉴定的梭菌类菌属；杆菌菌纲主要为Acidibacillus和Alicyclobacillus，前者为异养的铁硫氧化菌属，后者重金属耐受能力强，主要通过利用有机质和其它菌属的代谢产物进行生长，能促进铁氧化/还原菌属的生长[16，17]。此外，在下层水区域，能降解植物聚合物、降解纤维素和反硝化细菌的相对丰度显著升高，这些微生物通过分解动植物植物残骸中的有机质来为酸水库提供碳源，同时参与水库中的氮循化过程[18]。

图3 门水平微生物相对丰度的垂向变化

4 结论

酸水库中存在含量丰富，种群多样，功能各异的嗜酸微生物，且表现出了明显的空间结构差异。表层水中细菌主要为铁硫氧化还原功能的变形菌门，下层水则以对环境压力耐受性强的厚壁菌门，及参与厌氧代谢过程的变形菌门和放线菌门为主，微生物空间分层的主要推动力为水质的pH值，DO和Fe2+浓度，下层水体pH值高，亚铁含量高，溶解氧低，适宜多种微生物生长代谢，生物多样性更为平均；而表层水体pH值较低，受温度，大气氧化影响，同时水体中的固氮固碳生物能利用大气中的氮气和CO2支持自身生长繁殖，该区域占据优势的大多为好氧的嗜酸异养菌属。