王淑婷，唐玉倩，刘增才，邹莉

(东北林业大学林学院，哈尔滨 150040)

暴马桑黄(Sanghuangporusbaumii)是寄生在暴马丁香树上的一种药用价值较高的大型真菌，具有抗菌消炎[1]、降血糖[2]、保护肝脏[3-4]、抗癌[5]等功效。其良好的药用效果主要源于其含有的多糖、黄酮、酚类、三萜等活性成分[6-7]。但是这些成分在暴马桑黄中含量很低[8]，难以满足生产需求。近年来，随着分子生物技术的发展，利用基因工程定向培育优质的暴马桑黄菌株成为一种可靠的技术手段，目前转基因技术已在多种真菌中成功实现，1986年MUNOZ-RIVAS等人在色氨酸营养缺陷型裂褶菌突变株中转入TRPC基因，成功获得正常菌株[9]；李刚等人在通过PEG转换缓冲液将大肠杆菌潮霉素B转磷酸酶基因转化到灵芝中，成功转化出能稳定表达出HmB抗性的转基因灵芝品种[10]。但目前食药用菌遗传转化依旧存在转化表达效率低的问题[11]，启动子是控制基因表达的重要工具，因此找到合适的启动子是提高食药用菌转化表达效率的关键。

食药用菌遗传转化所采用的启动子主要有两种：一种是ras启动子，另一种则是gpd启动子[12]。Hirano等在1999年从香菇中分离出gpd启动子，将其用于香菇转化体系的构建，结果显示该体系比ras启动子转化体系的表达效率高[13]，这说明gpd启动子比ras启动子具有更强的调控外源基因表达的能力。此外，gpd启动子已被用于灵芝[14]、双孢蘑菇[15]等多种食用菌转化表达载体的构建，表明运用gpd启动子进行食用菌转化有很高的可行性。本试验通过对暴马桑黄中分离出的gpd基因启动子序列进行克隆及序列分析，为建立高效稳定的暴马桑黄外源基因表达体系奠定基础，从而获得优质的目标菌株。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验菌株。本研究采用的菌种经ITS鉴定为暴马桑黄(GenBank登录号为KP974834)，保藏于东北林业大学森林保护学科实验室。

1.1.2 试验试剂。DL Marker 2000、DL Marker 10000、6×Loding Buffer、Premix Taq酶、pMD18-T vector均购自大连Takara公司。Tryptone和Yeast Extract购自Oxoid公司。氨苄青霉素购自纳川生物技术公司。基因组DNA提取试剂盒和琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化公司。其余药品均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 暴马桑黄菌丝培养与收集。将4 ℃保存的暴马桑黄菌种取出，在超净工作台中用灭过菌的接种钩挑取黄豆粒大小的菌块接种在PDA培养基中央，在25 ℃恒温培养箱中避光培养10 d左右，待菌丝长满平板后，将表面菌丝体收集到1.5 mL离心管中，-80 ℃保存备用。

1.2.2gpd启动子引物设计与合成。根据暴马桑黄基因组数据，通过BioEdit软件筛选得到暴马桑黄gpd启动子的电子序列，利用Primer Premier 5.0软件设计特异性引物，将其分别命名为gpd-F(5’-AGGTATGACAGTGGAACCAAGCA-3’)和gpd-R(5’-GCATTTCGGAGGACGATACGGC-3’)，在哈尔滨擎科生物公司进行引物合成。

1.2.3gpd启动子序列扩增及测序。利用植物基因组DNA提取试剂盒提取暴马桑黄总DNA，以得到的DNA为模板，gpd-F和gpd-R为引物，对暴马桑黄gpd启动子序列进行PCR扩增。PCR扩增产物用琼脂凝胶电泳检测，纯化回收后检测回收产物浓度。将纯化回收的gpd启动子序列与PMD18-T载体相连接并转化进入DH5α感受态细胞，克隆、筛选和检验后送至哈尔滨擎科生物公司测序，并将序列提交到GenBank。

1.2.4gpd启动子序列分析。利用Neural Network Promoter Prediction(http://fruitfly.org/seq_tools/promoter.html)在线网页对暴马桑黄gpd启动子的核心启动子区进行分析，利用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)以及Gene Promoter Miner(http://gpminer.mbc.nctu.edu.tw/index.php)对暴马桑黄gpd启动子序列的作用元件、CpG岛及转录因子结合位点分析[16]。

1.2.5gpd启动子系统发育分析。将暴马桑黄gpd启动子序列测序结果提交至NCBI进行BLAST同源性分析，采用MEGA4软件构建暴马桑黄与近缘真菌gpd启动子序列的系统发育树。

2 结果与分析

2.1 gpd启动子的PCR扩增结果及胶回收质量检测

M.Marker 2000；1. PCR扩增产物；2.胶回收产物

以暴马桑黄总DNA为模板，gpd-F和gpd-R为引物进行PCR扩增，扩增产物采用1%琼脂凝胶电泳进行检测，结果在大约1400 bp处显示出特异性条带；胶回收DNA凝胶电泳检测得到质量较好的单一条带(图1)。

2.2 gpd启动子的连接、转化

将回收的DNA溶液与pMD18-T vector过夜连接，然后转入大肠杆菌DH5α感受态细胞进行培养，37 ℃培养13 h后，随机挑选6个单菌落进行摇菌扩繁，然后进行菌液PCR扩增检测。检测结果显示扩增出的条带均呈阳性，大约1500 bp(包含约100 bp的载体序列)，表明目的片段转化成功(图2)。阳性的克隆产物在哈尔滨擎科生物公司测序后提交至GenBank (登录号为MT779798)。

M.Marker 10000；1-6.菌液PCR扩增产物

2.3 gpd启动子的序列分析

2.3.1 gpd启动子核心启动子区分析

核心启动子区是转录因子与RNA聚合酶在启动子上的结合区域，对启动子的活性有较大影响[17]。利用Neural Network Promoter Prediction对暴马桑黄gpd启动子的核心启动子区进行分析，结果预测到3个核心启动子区(表1)，其中在995-1045 bp之间为核心启动子区的概率最高，为0.99，其余两处均低于0.90。

表1 暴马桑黄gpd启动子核心启动子区预测

2.3.2gpd启动子序列作用元件分析。利用plantcare对gpd启动子作用元件分析。结果发现暴马桑黄gpd启动子除了含有CAAT-box、TATA-box等典型的启动子顺式作用元件之外，还含有CCAAT-box、G-box、A-box、LTR、ABRE、STRE、MYB等多种重要的作用元件，部分重要元件在gpd序列中的位置及有关功能见表2及图3，多种暴马桑黄gpd启动子作用元件的存在表明克隆得到的目的基因序列具有调控基因表达的功能。

表2 暴马桑黄gpd启动子的作用元件种类与功能

2.3.3 CpG岛预测及分析。CPG岛常位于真核生物编码基因的调控区，其中启动子区中处于非甲基化状态的CpG岛是基因转录所必需的；转录因子结合位点是启动子上与转录因子相结合的DNA片段，是一些起始转录的关键结合部位。通过Gene Promoter Miner对暴马桑黄gpd启动子序列的CpG岛及转录因子结合位点进行预测分析，结果显示序列在7-1380 bp之间有一个CpG岛(图3)，并且发现启动子序列中还具有AP1、MAF、OCT1、STAT6、SREBP、IPF1、OSF2等多种转录因子的结合位点。

暗色部分代表CpG岛

2.3.4 暴马桑黄与其它真菌gpd启动子序列系统发育分析。在NCBI网站上对暴马桑黄gpd启动子序列进行BLAST比对，获得近缘真菌gpd序列，采用MEGA4软件构建暴马桑黄与其近源真菌gpd启动子序列系统发育树(图4)。发现暴马桑黄gpd启动子与香菇(GQ457137.1)及糙皮侧耳(HQ286597.1)的gpd启动子序列同源性相对高，与韦伯灵芝(MN010574.1)和云芝(AY081189.1)等之间的相似性较低，表明gpd启动子序列在食用真菌种类范围内保守性不强，也可能因为在暴马桑黄中还存在其他gpd启动子[18]。

图4 暴马桑黄与其它真菌gpd启动子的系统发育分析

3 讨论

gpd启动子具有的强大调控外源基因表达的能力，使其成为食用菌遗传转化体系中重要的调控工具。本研究从暴马桑黄中克隆得到一段1380 bp的gpd启动子序列，通过分析发现gpd启动子在995-1045 bp之间是核心启动子区概率最高(0.99)，说明该部位最有可能是转录因子和RNA聚合酶结合的区域，该结果有待于进一步验证。其含有典型的启动子顺式作用元件CAAT-box、TATA-box等，以及其他重要作用元件如CCAAT-box、G-box、A-box。TATA-box是决定基因转录的关键作用元件，RNA聚合酶与TATA框牢固结合后才能开始转录。在该序列中，共有8个TATA-box，其中4个在正链上，这些TATA-box集中分布在gpd基因启动子的后半段。CAAT-box是启动子行使正常功能的重要元件，控制转录的起始频率，在暴马桑黄gpd启动子中共发现13个CAAT-box，且CAAT-box在转录起始点前37-109 bp的区域内分布较集中，与前人研究一致[19]，同时也可推测本研究克隆的gpd启动子具有正常的转录功能。除此之外，在该启动子中还发现了参与光反应的G-box、参与低温响应的LTR、参与脱落酸反应的ABRE等重要顺式元件。

此外，经过预测发现，克隆得到的暴马桑黄gpd启动子序列具有多个转录因子结合位点，说明克隆得到的启动子参与多种基因表达的调控。根据是否含有CpG岛可将启动子分为CpG启动子和非CpG启动子，启动子中的CpG岛在转录过程中有重要作用[20]，经预测暴马桑黄gpd启动子序列在7-1380 bp之间存在一个CpG岛。但是根据已有研究，目前发现的CpG岛长度一般在500-1000 bp，此研究预测得到的CpG岛却长达1373 bp，出现该结果的原因尚待进一步研究。

以上序列的分析结果可以初步断定暴马桑黄gpd启动子序列具有启动子功能，能起到起始转录的作用。本研究结果能够应用于建立高效、稳定的暴马桑黄遗传转化体系，为利用基因工程培育更多目标菌株奠定基础。