陈晓亮马世龙杜金叶殷丽丽

(1.山西大同大学医学院，山西 大同 037009；2.山西大同大学生命科学学院；山西 大同 037009)

黄芩(Scutellaria baicalensis Georgi)属唇形科多年生草本植物，在我国栽培历史悠久，其根经干燥后入药，具有抗炎、降压、解毒、利尿、安胎等功效[1]。黄芩含有黄酮类、萜类、多糖等多种活性成分[2]，其中黄酮类物质具有抗病毒、抗菌和抗癌等功效[3-5]。目前，植物中黄酮类物质常用水煎煮提取法[6]、乙醇提取法[7]、超声波提取法[8]、微波提取法[9]等，在规模化生产中主要为水煎煮提取法和乙醇提取法，然而水煎煮法存在提取率较低、杂质多等问题[10]。因此，本研究采用正交分析对乙醇提取法的影响因素进行优化，为工业上高效提取黄芩总黄酮的效率提供了理论依据。

1 材料和方法

1.1 试验材料

试验用黄芩购于大同市中医院中药房，芦丁标准品购于上海诗丹德标准技术服务有限公司(产品批号：153-18-4)，其余试验所用试剂均为分析纯。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁标准曲线制作

用Al(NO3)3-NaNO2显色法，以300～800nm波长扫描黄芩总黄酮提取液和芦丁标准品溶液吸收峰，检测发现2种溶液的最大吸收值均为505nm。因此，在505nm波长下检测不同浓度的芦丁标准品，得标准回归方程：

Y=10.2395X+0.0091(R2=0.9994)

1.2.2 黄芩总黄酮得率的计算

将黄芩根干燥粉碎后过60目筛，-20℃分装储存，备用。取1g黄芩样品，浸入一定浓度乙醇，置于恒温水浴中回流提取1h后，将回流液移入100mL的容量瓶中定容，利用Al(NO3)3-NaNO2显色法，根据标准回归方程，以505nm波长下吸光值计算总黄酮浓度，从而得到黄芩总黄酮的得率。

1.2.3 单因素实验

按照Al(NO3)3-NaNO2显色法检测不同乙醇提取浓度(40%、50%、60%、70%和80%)、不同液固比(20∶1、30∶1、40∶1、50∶1和60∶1)及不同提取温度(40℃、50℃、60℃、70℃和80℃)时的总黄酮得率。

1.2.4 正交法优化提取工艺

将以上单因素各选取3个水平进行正交试验，如表1所示。

表1 正交试验因素水平

1.2.5 细胞增殖能力检测

取4×104·mL-1的SMMC-7721、HT-29细胞接种于96孔板，于37℃，5%CO2过夜培养。用含0mg·mL-1、50mg·mL-1、100mg·mL-1、200mg·mL-1、400mg·mL-1总黄酮完全培养液分别培养24h、48h和72h后弃培养液，每孔加入100μL含10%MTT的培养液，继续培养4h后在570nm波长处检测吸光值(A)，计算总黄酮对细胞的抑制率。

细胞相对抑制率=(A对照-A实验)/(A对照-A空白)×100%

1.3 数据分析

试验数据采用SPSS 18.0软件进行处理和分析。

2 结果与分析

2.1 单因素实验结果

2.1.1 乙醇浓度对黄芩总黄酮得率的影响

当液固比为30∶1，提取温度为50℃时，检测乙醇浓度为40%、50%、60%、70%和80%时总黄酮得率。结果如图1，当提取剂浓度为60%时，总黄酮得率最大，此时黄芩中总黄酮得率为14.87%，与提取浓度为40%和50%时的总黄酮得率差异显著，但与提取浓度为70%时的总黄酮得率差异不显著，当提取溶剂的浓度继续增加时，总黄酮得率反而下降。

2.1.2 不同液固比对黄芩总黄酮得率的影响

当提取溶剂乙醇浓度为60%，提取温度为50℃，检测不同液固比时的总黄酮得率。结果如图2，当液固比为20∶1时，总黄酮得率最低；当液固比为30∶1、40∶1和50∶1时，总黄酮得率差异不显著；液固比为50∶1时，总黄酮得率最大，为14.59%；当液固比为60∶1时，总黄酮得率下降，但与液固比为50∶1时差异不显著。

2.1.3 提取温度对黄芩总黄酮得率的影响

当乙醇浓度为60%，提取液固比例为30∶1，分析不同提取温度(40℃、50℃、60℃、70℃和80℃)时总黄酮的得率。结果如图3，当温度为60℃时，黄芩总黄酮得率最高，为13.49%，与40℃和50℃时的总黄酮得率差异显著，但与70℃时的总黄酮得率差异不显著，当提取温度继续升高时，总黄酮得率随之下降。

2.1.4 正交试验

由单因素试验结果可知乙醇浓度、液固比及提取温度均会影响黄芩中黄酮总得率，将这3个因素各选取3个水平，其中乙醇体积分数为50%、60%和70%，液固比为40∶1、50∶1和60∶1，提取温度为50℃、60℃和70℃，按照L9(33)进行正交试验，探究不同提取组合对黄芩中黄酮总得率的影响。

方差分析表明，所选的3个因素对总黄酮得率具有显著影响(P<0.05)，结果见表2；极差分析显示，极差RA>RC>RB，见表3。因此，乙醇浓度对总黄酮提取得率影响最大，液固比影响最小。各因素对黄酮总得率的平均值分析表明，乙醇浓度(A)中K2最大，液固比(B)中K1最大，提取温度(C)中K2值最大，见表3。因此，总黄酮最佳提取条件为A2B1C2，此时黄芩中黄酮总得率为15.68%，标准差为1.09%，表明该提取条件具有较好的稳定性，所选的参数可行。

表2 黄芩总黄酮提取工艺方差分析

表3 黄芩总黄酮提取工艺L9(33)正交试验结果

2.1.5 黄芩总黄酮提取物抗肿瘤活性研究

MTT法检测黄芩总黄酮对人肝癌细胞SMMC-7721、人结肠癌细胞HT-29增殖的作用，结果如图4所示。用25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1、400μg·mL-1黄芩总黄酮处理SMMC-7721细胞24h、48h、72h，IC50分别为1024μg·mL-1、533.6μg·mL-1、287.7μg·mL-1；用25μg·mL-1、50μg·mL-1、100μg·mL-1、200μg·mL-1、400μg·mL-1黄芩总黄酮处理HT-29细胞24h、48h、72h，IC50分别为830.5μg·mL-1、372.5μg·mL-1、264.2μg·mL-1。结果表明，黄芩总黄酮对SMMC-7721细胞、HT-29细胞具有显著抑制作用，且呈明显的时间和剂量依赖性。

3 结论与讨论

黄酮类物质具有抗病毒、抗癌、抗氧自由基等作用，溶于有机溶剂。因此，本研究选用乙醇作为总黄酮提取剂，采用单因素试验和正交试验评价总黄酮得率，为工业上黄酮提取提供了参考依据。

单因素试验结果表明，当乙醇浓度为60%时，黄芩中总黄酮的极性与60%的乙醇的极性最相似[11]，黄酮从植物细胞中溶出率高，黄酮总得率最高，当乙醇浓度继续增加时，黄酮类物质的溶出因溶液极性减弱而降低[12]，所以试验中乙醇浓度为80%时，总黄酮得率降低；单因素试验中当液固比为50∶1时，黄酮总得率最高，液固比的增大可以增加提取溶剂和原料的接触效果，有利于提高溶出物的扩散速度，从而可提高黄酮总得率，但当液固比增大时，黄芩中的其它物质与黄酮竞争溶剂而影响黄酮的提取率[13]；当提取温度高于60℃时，黄酮总得率降低，可能是提取温度过高破坏了黄芩中黄酮类物质的稳定性，导致总黄酮含量降低[14]，而在提取温度为60℃时，黄酮溶出效果最高。

正交试验设计广泛应用于提取工艺的优化[15]。本研究采用正交试验对黄芩中总黄酮提取过程进行了优化，当乙醇体积分数为60%，提取溶剂与黄芩比例为40∶1，提取温度为60℃时，总黄酮得率最高，为15.68%，该提取条件具有较好的稳定性，且试验所采用的3个因素中乙醇提取浓度对提取率影响最大，其次为提取温度。

黄芩作为很多中成药的原料药在临床上应用广泛，近年来对黄芩抗肿瘤活性的研究也日趋深入。本研究表明，黄酮提取物可抑制肝癌细胞SMMC-7721和人结肠癌细胞HT-29的增殖，但其抑制机制尚未完全明确。黄芩中总黄酮提取物成分复杂，今后应分离总黄酮活性成分，以期更全面地评价黄芩中抑制癌细胞增殖的活性成分及作用机理，为临床上制备新的抗肿瘤药物提供理论支持。