侯 俊，廖 琼，周成敏，谭燕勤

与EBV感染相关的疾病有鼻咽癌、NK/T细胞淋巴瘤、EBV相关性胃癌、淋巴上皮瘤样癌、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤等。原位杂交是检测组织EBV感染的金标准，与PCR和免疫组化相比，原位杂交具有高度灵敏性和特异性，组织定位明确。目前最常用的EBER原位杂交试剂分别有适用于手工和全自动免疫组化染色仪两种类型的试剂盒。本实验使用北京中杉金桥公司的手工检测试剂盒和罗氏EBER全自动检测试剂盒同时对淋巴瘤、EBV相关性胃癌、鼻咽癌几种不同类型标本进行检测，现将检测结果报告如下。

1 材料与方法

1.1 标本选取四川省肿瘤医院2014～2020年EBV感染相关病例20例(手术切除标本8例、活检小组织8例、穿刺组织4例)。常规石蜡切片，切片厚度4 μm。每个样本连续切片3张，分别使用阳离子防脱载玻片2张(用于手工检测及HE染色)和日本松浪基膜载玻片1张(用于全自动检测)。待检切片均使用65 ℃烤片60 min。

1.2 仪器设备BenchMark ULTRA、恒温孵育箱。

1.3 试剂地高辛染色液试剂盒(北京中杉金桥公司)、二甲苯、95%乙醇、无水乙醇、TBS缓冲液、蒸馏水、中性树胶、苏木精染色液、水溶性伊红染色液，罗氏原位杂交EBER试剂盒以及配套的仪器使用试剂。

1.4 方法

1.4.1全自动染色检测 切片使用Benchmark ULTRA全自动检测：加热模块升温EZ液脱蜡，CC2细胞修复95 ℃ 4 min，Reaction Buffer清洗，加EBER探针杂交，86 ℃杂交8 min，SSC清洗；加Iview anti-fluorescein(鼠抗FITC一抗)去结合探针，孵育20 min；加Iview blue biotinylated Ig(生物素标记的山羊抗鼠Ig)孵育8 min；加Iview blue SA_AP(碱性磷酸酶标记的链霉亲和素)孵育16 min；加Iview blue enhancer(MgCl2)孵育8 min；加Iview blue NBT和Iview blue BCIP孵育32 min显色；加Red Stain II复染4 min；染色结束，蒸馏水洗；40 ℃烤箱烤干切片，用新鲜二甲苯漂洗切片(忌乙醇)；中性树胶封固。

1.4.2手工染色检测 切片脱蜡至95%乙醇后，空气干燥5 min；每张切片滴加足够量的胃酶工作液入37 ℃孵箱孵育10～20 min；弃去胃酶工作液，95%乙醇、无水乙醇脱水、空气干燥；切片滴加5～20 μL EBER探针，加盖硅化盖玻片，37 ℃杂交过夜(孵育盒内保湿)；TBS缓冲液洗去盖玻片；TBS缓冲液洗3 min×3次；滴加HRP标记抗地高辛抗体50～100 μL，37 ℃孵育30 min；TBS缓冲液冲洗3 min×3次，暗处DAB显色3 min；回收DAB显色液，蒸馏水冲洗，苏木精复染，乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封固。

2 结果

全自动检测试剂盒染色EBER阳性部位显示为紫色(BCIP/NBT显色)，核固红复染，呈红色；手工检测试剂盒染色EBER阳性部位显示为棕色(DAB显色)，苏木精复染细胞核呈蓝紫色。两种检测方式均得到了很好的染色效果(图1、2)。其中2例穿刺样本组织形态结构疏松，条形组织的两侧边缘出现了明显挤压、牵拉，全自动检测，视野内阳性为30%，组织边缘出现非特异着色(图3)；使用手工检测，视野内阳性为50%，组织边缘未见非特异性着色(图4)。

图1 肺淋巴上皮瘤样癌使用BenchMark ULTRA自动化染色，原位杂交 图2 肺淋巴上皮瘤样癌使用手工检测，原位杂交 图3 鼻咽癌颈淋巴结转移穿刺样本使用BenchMark ULTRA自动化染色，原位杂交 图4 鼻咽癌颈淋巴结转移穿刺样本使用手工检测，原位杂交

3 讨论

两种EBER原位杂交检测方法均适用于手术切除标本和活检小组织。穿刺取样可能对组织形态和结构造成不可逆影响，在组织形态和结构受到破坏的区域，细胞内的蛋白质和核酸无法得到很好保存，导致这些区域出现非特异染色或阳性染色信号减少。本组选取了4例5～6年前手术切除样本，两种检测方式均能取得很好的检测结果。由此推断，在样本前处理得当的情况下，EBV核酸能够在常规石蜡样本中有效保存较长时间不被降解，可选用5年内前处理良好的蜡块进行EBER原位杂交。

在穿刺样本检测中，手工染色检测与全自动染色检测相比，具有相对更好的特异性和敏感性(图3、4)。本组2例穿刺样本使用全自动检测阳性约为30%，组织边缘出现非特异着色；使用手工检测阳性约为50%，组织边缘未见非特异性着色。由此得出结论：在穿刺样本检测中，使用手工检测的特异性、敏感性方面优于全自动检测，使用全自动检测存在假阴性的风险，我们需评估全自动检测带来的假阴性风险，穿刺样本建议使用手工试剂盒检测。全自动免疫组化平台在规范化、标准化检测方面对比手工检测有着不可比拟的优势，然而并非所有类型的样本均适用于全自动检测。

本实验在EBER原位杂交检测使用中体会：(1)载玻片的选择：使用手工染色检测时建议使用阳离子载玻片。使用全自动Benchmark ULTRA平台需选用仪器适配的基膜载玻片。(2)对照设置：在检测过程中，建议每个待测样本均设立阳性对照[1]。(3)切片厚度：推荐4 μm厚。切片过薄，手工检测酶消化时间不容易把握、阳性信号强度较弱；切片过厚，细胞重叠不利于观察，也更容易掉片。(4)结果判读：手工检测使用DAB显色，苏木精复染，形态结构清晰，判读容易；全自动检测EBER阳性部位显示为紫色(BCIP/NBT显色)，背景染色为核固红。核固红在细胞中的着色较均匀一致，与组织形态对比度略显不够[2]。(5)样本前处理：手术切除标本需在标本离体后30 min内用4～10倍中性缓冲福尔马林进行固定[3]；小组织样本，如需当日进行脱水处理的小组织样本，需保证至少固定6 h[4]。(6)操作步骤严格按照实验室SOP进行，试剂盒说明书提供的相关流程仅作为实验室相关SOP的参考。(7)胃蛋白酶消化：消化恰当与否需把握好2个关键点，①充分暴露靶核酸；②保留组织细胞轮廓。对细胞较为密集的淋巴结常选用20 min消化时间；对细胞相对疏松的鼻咽部活检组织常选用10～15 min消化时间；对评分较低的样本和玻片，常使用不超过10 min的酶消化处理。而全自动原位杂交EBER试剂盒染色暴露靶核酸的方式选用柠檬酸加热，对组织细胞轮廓能很好的保留。(8)探针的类型和特点：全自动检测试剂盒为寡核苷酸探针、手工试剂盒为DNA探针。DNA探针的特点是特异性高、形成的杂交体稳定、不产生自身粘连，不需灭活RNA酶，但实验全程需佩戴口罩、手套，寡核苷酸探针的特点是特异性高、杂交时间短、特异性和敏感性相对略低。(9)不同样本类型建议选择不同的适合的检测方法。(10)全自动免疫组化检测并不能完全替代手工检测。