李 丽，陈 菲，包春娟，周琪琪，包 骥

抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate-resistant acid phosphase, TRAP)是破骨细胞的特异性标志酶，TRAP染色显示破骨细胞胞质中TRAP的活性，是破骨细胞的特异性染色[1]。本文首次采用TRAP染色与免疫组化套染技术，帮助研究者实现在同一张脱钙骨组织石蜡切片上观察破骨细胞与血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)共表达情况，该套染技术在国内外尚未见报道。脱钙骨组织制片比软组织制片过程繁琐且易出现脱片、染色背景深等问题，作者经反复摸索优化实验步骤，现将该套染技术介绍如下。

1 材料与方法

1.1 材料(1)样本制片：兔股骨髁骨缺损处填充直径为7 mm的羟基磷灰石生物材料，造模后于不同时间点取材，离体骨组织立即用10%中性缓冲福尔马林固定，固定后用硬组织切片机将兔股骨切成3 mm厚薄片再继续固定48 h，用改良EDTA脱钙液脱钙[2]，脱钙液置于37 ℃水浴锅，每2天更换1次脱钙液。待骨组织脱钙完全后行常规石蜡包埋，4 μm厚连续切片，其中1片行常规HE染色。(2)试剂：TRAP染色试剂盒购自德国Sigma-Aldrich(387A-1KT)；Rabbit anti-VEGF抗体(1 ∶100，Abcam公司，货号ab28775)；抗体稀释液(DAKO公司，货号：S2022)；Wash Buffer(DAKO公司，货号DM831)；免疫组化试剂盒REAL EnVision(DAKO公司，K5007)；苏木精染液(Thermo公司，货号7211)。(3)耗材：Super PAP Pen超级免疫组化油笔(福州迈新公司，货号PEN-0002)。(4)大型设备：硬组织切片机(西安蓝茗医疗科技公司)；全自动封片仪(Thermo，ClearVue)；WSI全数字切片扫描仪(3DHISTECH，Pannoramic SCAN)。

1.2 方法

1.2.1TRAP染色 (1)石蜡切片常规脱蜡至流水冲洗；(2)双蒸水充分洗涤后，将装有待染切片的双蒸水染色盒放入37 ℃水浴锅中静置15 min；(3)按照TRAP染色试剂盒说明书配制TRAP孵育液，即用即配；(4)将待染切片放入37 ℃ TRAP孵育液内避光浸染60 min；(5)37 ℃双蒸水快洗2次，每次5 s；(6)流水冲洗5 min，双蒸水充分洗涤。

1.2.2免疫组化染色 实验在TRAP的基础上，再叠加免疫组化染色。(1)阻断内源性过氧化物酶，1.5%H2O2(甲醇配制)室温避光封闭10 min[3]；(2)流水冲洗5 min，蒸馏水充分洗涤后用免疫组化油笔在组织周围画圈，置入Wash Buffer液中洗涤3次，每次2 min；(3)滴加100 μL一抗VEGF工作液于组织上，4 ℃冰箱孵育过夜；(4)Wash Buffer洗涤3次后，滴加100 μL EnVision试剂盒中的A液，37 ℃孵育30 min；(5)Wash Buffer洗涤3次后DAB显微镜下控制显色；(6)苏木精复染，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，全自动封片仪封片，全数字切片扫描。

2 结果

大体可见兔股骨髁骨缺损处填充的生物材料与周围宿主骨组织连接紧密，HE染色可见大量生物材料被吸收，其内散在炎细胞、破骨样细胞浸润，材料内可见较多新生骨组织形成(图1)。TRAP单染可见兔股骨髁骨缺损处生物材料内散在细胞胞质暗红色，细胞核蓝色，胞体大，核数量不等的破骨细胞分布，其余细胞胞质不显色，TRAP染色与VEGF免疫组化套染可见兔股骨髁骨缺损处生物材料内VEGF在新生骨组织细胞、部分破骨细胞、新生血管内皮及部分炎细胞胞质呈棕黄色表达，破骨细胞胞质暗红色，胞核蓝色，其余细胞胞核蓝色、胞质不显色且背景干净(图2)。

图1 A.兔股骨髁骨缺损造模后大体所见，箭头所示类圆形区域为股骨髁骨缺损处填充的生物活性材料；B.HE染色可见填充的生物材料与周围宿主骨组织连成一片，生物材料被吸收，其内散在炎细胞、破骨样细胞浸润，生物材料内可见较多新生骨组织形成

图2 A.兔股骨髁骨缺损处生物材料内可见细胞质暗红色，细胞核为蓝色，胞体大，核数量不等的破骨细胞散在分布，其余细胞质不显色，TRAP单染；B.兔股骨髁骨缺损处生物材料内可见VEGF在新生骨组织细胞、部分破骨细胞、新生血管内皮及部分炎细胞胞质呈棕黄色阳性，破骨细胞胞质暗红色，胞核蓝色，其余细胞核蓝色、胞质不显色，背景干净，TRAP+VEGF套染

3 讨论

骨组织损伤修复基础研究中，VEGF增强缺损处血管通透性，诱导新骨形成的同时也加速破骨细胞的骨吸收，促进骨愈合[4]。破骨细胞起源于造血干细胞，与执行骨形成功能的成骨细胞处于动态平衡。研究者试图在同一张脱钙骨组织石蜡切片上观察破骨细胞与VEGF的共表达。本实验采用TRAP染色与VEGF免疫组化套染技术，经反复实验发现该套染技术成功需要注意以下几方面。(1)骨组织离体后处理：骨组织离体后除立即使用10%中性缓冲福尔马林固定外[5]，还使用硬组织切片机将骨组织修切成3 mm厚薄片，以便固定液充分渗透到骨组织内部得到最佳固定效果。骨组织比软组织致密，若不切开固定，固定液渗透慢导致固定欠佳，导致不能较好地保存骨组织内部细胞形态结构、TRAP酶及抗原。固定不佳的组织后续脱水处理不佳，增加组织脱片的风险。本实验脱钙液选择文献报道的改良脱钙液[2]，脱钙和固定同时进行，脱钙使用37 ℃水浴加快脱钙速度，以保证在最短的时间内脱钙完全。组织离体后进行该处理方法可大大降低脱片、TRAP酶及抗原丢失的风险。(2)TRAP染色：TRAP染液容易失效，每次实验前待染切片置于37 ℃水浴锅中静置15 min时即可配制TRAP孵育液，现用现配。机体离体后应立即充分固定，尽量避免因操作不当造成TRAP酶丢失导致实验出现假阴性。TRAP孵育液结束后用37 ℃双蒸水冲洗2次，不容易出现脱片，且背景干净无文献里提到的颗粒沉淀[1]。为保证每张切片的染色质量，TRAP染色不建议使用滴染，本文连续切片行TRAP染色实验中滴染的破骨细胞数少于浸染操作的破骨细胞数量，滴染破骨细胞胞质内暗红色程度也较浸染弱。(3)VEGF免疫组化染色：本实验采用EnVision非生物素检测系统，能较好避免组织内源性生物素干扰导致的非特异背景表达。然而DAB显色系统不可避免内源性过氧化物酶存在产生非特异背景表达。本实验采用1.5%H2O2(甲醇配制)室温避光封闭10 min，能避免脱片及降低非特异背景着色[3]。石蜡切片行免疫组化染色时，为最大程度暴露10%中性缓冲福尔马林固定交联的抗原表位，需采用最佳抗原修复条件[6]。本文采用胃酶、胰酶消化、柠檬酸水浴修复及不修复4种不同抗原修复方式，结果显示不修复切片VEGF表达最强且背景最弱，脱片率最低。这与文献报道的骨组织行免疫组化时如一抗选用多克隆抗体可以不经过抗原修复结果一致[7]。黄建平等[8]也报道对大多数抗原一般提倡抗原修复，但对于某些特殊抗原如HBcAg未修复的切片表达效果较好。

综上所述，TRAP染色与VEGF免疫组化套染技术虽步骤较多，但操作简便，染色效果较好，值得推广。