王 弦，江冬瑞，李晓灿，黄成晨，吴 强

HER-2基因属于原癌基因，HER-2阳性乳腺癌恶性程度较高且易复发转移。目前国内外已有针对HER-2基因过表达的靶向药物(赫赛汀)，可大大降低乳腺癌患者的恶性风险。因此，确定乳腺癌HER-2的状态非常重要。针对HER-2的检测方法主要有免疫组化法和原位杂交法，原位杂交法中荧光原位杂交法效果最佳，其是直接针对HER-2基因扩增检测，并设置了17号染色体着丝粒作为内对照[1-2]，但该方法对实验设备、操作人员要求均较高，检测费用是免疫组化法的10～15倍。因此，乳腺癌患者应先行HER-2免疫组化检测，如果判读为2+，可再行荧光原位杂交法检测。然而，国内医院病理科因检测水平参差不齐、主观判读因素及抗体原因，导致HER-2判读为2+的检测可重复性不高。因此，免疫组化法检测乳腺癌患者HER-2表达添加质控对照显得尤为重要。本科室在多年标准化检测HER-2的基础上，利用组织芯片的原理并借鉴成功经验[3]，摸索出制作乳腺癌HER-2免疫组化简易芯片对照的方法，可使染色结果判读更为客观，效果良好，现介绍如下。

1 材料与方法

1.1 标本收集2019年1月～2020年4月安徽医科大学第二附属医院病理科存档的乳腺癌手术标本30例作为供体蜡块，患者均为女性。所有标本均经10%中性缓冲福尔马林固定，常规脱水，透明，浸蜡，包埋。

1.2 试剂及设备全自动免疫组化仪；抗HER-2兔单克隆抗体(克隆号4B5，即用型)、UrtalView HRP-Multimer DAB免疫组化检测试剂盒、CC1(pH 9.0)修复液、Reaction Buffer缓冲液、EZ脱蜡液、LCS液盖膜；正电荷黏附载玻片。

1.3 方法

1.3.1供体标本的染色 所有供体蜡块4 μm厚切片，使用正电荷黏附载玻片捞片，65 ℃烤片2 h；全自动免疫组化仪按照预设程序染色(CC1修复液100 ℃ 修复30 min；一抗HER-2 37 ℃孵育32 min；二抗系统HRP-Multimer 37 ℃孵育8 min；DAB显色37 ℃ 8 min；苏木精复染)；染色结束后人工清洗玻片并脱水透明封固。

1.3.2结果判读 HER-2阳性定位于肿瘤细胞膜，结果判读标准参考《乳腺癌HER2检测指南(2019版)》[2]。

1.3.3供体蜡块的选择及简易芯片的制作 (1)从30例供体蜡块中选择染色效果最佳的-、1+、2+、3+各1例；(2)镜下观察切片，选定目标区域并调取相对应蜡块，并用记号笔在蜡块上对应区域做标记；(3)融解蜡块，用刀片切取标记的组织区域，切取组织区域，大小3 mm×3 mm，然后将切取的组织依次按照-、1+、2+、3+的顺序包埋在同一蜡块中；(4)在检测乳腺癌中HER-2的表达时，可将上述简易芯片对照裱在切片一端，与待检组织同时染色，染色程序同1.3.1。

2 结果

2.1 供体蜡块HER-2免疫组化染色30例供体蜡块免疫组化检测结果：HER-2(3+)9例，HER-2(2+)6例，HER-2(1+)8例，HER-2(-)7例(图1)。

图1 HER-2的表达，EnVision法：A.3+；B.2+；C.1+；D.-

2.2 简易芯片的制作及应用乳腺癌HER-2免疫组化简易芯片蜡块制作较为便利、排列有序、体积小、识别度高；易于标记和使用，可重复性强(使用完以后可再次挑选蜡块制作)(图2)。对制作完成后的简易芯片应用于待检组织HER-2免疫组化染色，芯片内各点染色结果与初筛时供体蜡块染色相同，无脱片、无移位(图3)。

图2 简易芯片蜡块：A～D分别为HER-2 (3+)、(2+)、(1+)、(-) 图3 简易芯片应用于待检组织：左侧A～D为简易芯片，右侧为待检组织

3 讨论

乳腺癌是女性高发恶性肿瘤之一，近年来发病率在我国呈逐年上升趋势，且临床复发率较高[4]。有研究表明，乳腺癌的发病与家族史、年龄、环境因素、内分泌因子及乳腺癌相关基因调控因子均有一定的关系[5]，故对于乳腺癌患者，早发现、早诊断、早治疗显得尤为重要。近20年来，免疫学及分子生物技术的运用给乳腺癌的早期诊断带来希望，尤其是分子靶向药物的研发和应用使大量乳腺癌患者受益，乳腺癌的病死率较之前大大降低。因此，能否正确诊断乳腺癌并明确其类型，尤其是明确肿瘤相应靶蛋白的表达，对于临床正确选择用药极其重要。

近年来，针对治疗HER-2阳性乳腺癌的曲妥珠单抗赫赛汀在临床上取得了较好的效果，一些新药如帕妥珠单抗、拉帕替尼等也逐渐应用于临床。因此，正确而有效的检测HER-2基因状态或其蛋白是否高表达是乳腺癌患者治疗用药和预后评价的关键。2006年我国发布了《乳腺癌HER-2检测指南》，截至2019年，专家多次对《乳腺癌HER-2检测指南》进行更新，在乳腺癌检测的标准化、规范化及其判读的客观化等方面进行指导，极大提高了我国的乳腺癌诊断水平。然而，我国乳腺癌HER-2的免疫组化检测水平不一，发达地区地市级以上医院病理科基本配备了全自动免疫组化染色仪，能够按照最新的《乳腺癌HER2检测指南(2019版)》[2]标准采用推荐的抗体及方法标准化检测，并建立了本实验室的SOP(实验室标准操作规程)，但更多的基层医院由于经济条件、技术水平等因素限制，并不能对HER-2的免疫组化进行规范检测。因此，为了保证诊断结果的准确性，乳腺癌HER-2的免疫组化检测需设立阳性对照，最好应设立已明确的具有不同HER-2染色强度的对照，从而保证不同批次染色的客观性。

本实验建立的HER-2简易芯片对照借助了组织芯片的原理，将HER-2不同阳性状态的组织整合到一个蜡块中，在进行免疫组化法检测乳腺癌中未知HER-2水平时作为对照裱附在同一张切片上。该技术具有如下优点：(1)传统的组织芯片制作需要有组织芯片仪，制作复杂，且对技术人员熟练程度要求高，难以掌握。本实验不需要组织芯片仪，仅需要调取选择蜡块后融化，切割后重新包埋，简单，易于掌握，成本低，易推广；(2)简易芯片中具备了HER-2(-)、(1+)、(2+)、(3+)四种状态的对照组织，与传统的单一阳性对照相比，其更为客观有效；(3)简易组织芯片构成比较单一，排列整齐，便于观察；(4)简易组织芯片体积小，可裱附在检测片的任何一端，与检测片同时检测，在相同条件下检测出染色结果，保证了实验结果的可比性。同时，针对使用全自动免疫组化仪的单位，也可以使用该简易芯片裱附在切片上任何区域，用来检测机器在运行时抗体混匀的状态；(5)该简易芯片质控样本来源广泛，可多次制作，在不同实验室之间可进行室间质控交流。

综上所述，采用简易芯片法制作HER-2免疫组化对照，设计科学，简易可行，使免疫组化检测结果判读更为客观可靠，值得推广。