吴 铃，王方平，张 敏，夏红珍，吴 景，何 杰

黏液表皮样癌(mucoepidermoid carcinoma, MEC)是涎腺最常见的恶性肿瘤，以儿童和年轻人最常见。最近研究表明，MEC一半以上存在t(11;19)(q21;p13)易位，该易位导致11号染色体Mastermind-like基因家族(MAML2)成员的第2～5号外显子断裂重排，并与19号染色体上的CRTC1外显子1产生融合(CRTC1-MAML2)[1-2]。约5%的MEC存在t(11;15)(q21;q26)易位和该易位导致的CRTC3-MAML2基因融合[2]，在低级别或中级别MEC中该基因融合发生率高，而高级别MEC一般未见CRTC1/3-MAML2基因融合，少数病例可见EWSR1-POU5F1基因融合，且高级别MEC中存在多个基因失衡，导致频繁复发或转移，预后不良[1-5]。有研究发现，MEC患者发生MAML2基因重排的生存率明显高于未融合者[6-7]。MAML2基因重排的检测还有助于MEC和Warthin瘤、腺鳞癌、透明细胞癌等进行诊断、鉴别诊断。本文收集28例原发于涎腺的MEC，采用MAML2基因重排、免疫组化、特殊染色、HE染色等检测方法，分析MEC分子遗传学和临床病理特征，为诊断和鉴别诊断及临床生物学行为的判断提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料收集2015年12月～2020年10月中国科学技术大学附属第一医院(安徽省立医院)临床病理中心及中国科学技术大学附属第一医院(安徽省肿瘤医院)病理科手术切除的28例MEC的临床病理资料。28例MEC患者男性10例，女性18例；均行肿瘤完整切除手术，其中12例术后行放疗，2例伴淋巴结转移；患者年龄14～76岁，中位年龄50岁。发生于腮腺部位者13例，非腮腺部位者15例。按照AJCC第八版涎腺恶性肿瘤分期标准对原发性涎腺MEC患者进行临床分期：Ⅰ～Ⅱ期 24例(86%)，Ⅲ～Ⅳ期4例(14%)。

1.2 方法标本均经10%中性福尔马林固定，常规脱水、石蜡包埋，4 μm厚连续切片，行免疫组化EnVision两步法染色。一抗CK7、p63、CK5/6、S-100、CD117和Ki-67，均为即用型抗体(北京中杉金桥公司)。在Ventana XT(罗氏公司)全自动免疫组化仪中进行操作，二抗及DAB显色系统为仪器自带封闭配套试剂。特殊染色AB/PAS试剂盒购自珠海贝索生物公司，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。MAML2基因断裂探针试剂盒购自武汉康录生物公司；显微镜下确认肿瘤细胞，根据MAML2双色断裂探针试剂盒说明书进行荧光原位杂交(fluorescence in situ hybridization， FISH)检测。

1.3 病理分级根据WHO(2006)头颈部肿瘤推荐的病理评分[8]标准对病例进行组织学分级：囊性成分少于20%为2分；伴神经侵犯为2分；伴坏死为3分；核分裂象≥4个/10 HPF为3分；退行性发育为4分。总分：0～4分为低级别，5～6分为中级别，≥7分为高级别。

1.4 结果判断

1.4.1免疫组化判断标准 肿瘤细胞标记呈棕黄色为阳性，其中CK5/6、CK7、CD117、S-100阳性定位于细胞质，p63和Ki-67阳性定位于细胞核。高倍镜下随机选取10个视野，按阳性细胞着色程度及所占百分比进行结果判定。(1)按阳性细胞着色计分：不着色为0分，弱着色或淡黄色为1分，中等着色或棕黄色为2分，强着色或棕褐色为3分。(2)按阳性细胞百分比计分：阳性细胞<25%为1分，25%～50%为2分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项得分相加：0～4分为阴性，>4分为阳性。特殊染色AB/PAS的判读标准：肿瘤细胞胞质染色呈蓝色及红色均为阳性。

1.4.2FISH判断标准 在1 000×油镜下计数肿瘤细胞核内荧光信号，正常细胞为绿色和红色融合呈黄色，MAML2断裂分离的细胞呈红色信号与绿色信号分离，或者单独出现红色信号。每例至少计数100个肿瘤细胞核中的信号，红、绿信号分离超过2个信号长度为异常信号，当异常信号的细胞数>20%则判读为阳性。

1.5 统计学分析实验数据采用SPSS 20.0软件进行统计学分析，计数资料比较采用Pearson χ2检验和Fisher精确概率法。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 眼观肿瘤多为实性不规则结节，直径0.5～8.0 cm，肿瘤切面呈灰白色、灰褐色，质地较软，常伴囊性变，囊内含黏稠的胶冻样物。

2.2 镜检MEC是由黏液细胞、中间型细胞和表皮样细胞构成，并以不同比例混合，可见3种肿瘤细胞之间相互移行过渡。本组结果显示：17例为低级别MEC，表皮样细胞分化较好，中间型细胞偏少，黏液细胞较常见(图1)，核分裂象、坏死较少见。其中有1例为Warthin瘤样变异型，与Warthin瘤相似，镜下见肿瘤由多个腺样乳头状结构构成，内层为柱状嗜酸性细胞，部分区域可由多层上皮构成，周围环绕具有生发中心的淋巴样组织，可见散在分布的黏液细胞(图2)；5例为中级别MEC，有1例为透明细胞变异型，肿瘤为胞质透明的多边形细胞，可见少量黏液细胞(图3)；6例为高级别MEC表皮样细胞及中间型细胞较多见，黏液细胞少见，细胞中-重度异型，呈弥漫实性巢团状(图4)，核分裂象、坏死易见，周围可见典型的低级别或中级别MEC区域。

图1 低级别MEC：表皮样细胞分化较好，中间型细胞偏少，黏液细胞较常见 图2 Warthin瘤样MEC：类似于Warthin瘤，内层为柱状嗜酸性细胞，周围环绕着具有生发中心的淋巴样组织，可见散在分布的黏液细胞 图3 透明细胞变异型MEC：胞质透明的多边形细胞，可见少量黏液细胞(箭头) 图4 高级别MEC可见少量黏液细胞(箭头)，表皮样细胞及中间型细胞多见，呈弥漫实性巢、团状 图5 腔面内层上皮中CK7呈弥漫强阳性，EnVision两步法 图6 外围基底细胞p63呈阳性，EnVision两步法 图7 AB/PAS呈阳性，特殊染色 图8 MAML2基因重排阳性：出现红色与绿色信号的分离，FISH法 图9 MAML2基因重排阴性：红色与绿色信号融合呈黄色，FISH法

2.3 免疫组化及特殊染色上皮样细胞CK7(图5)、p63(图6)、CK5/6均阳性，S-100、CD117均阴性，Ki-67增殖指数低(27例为2%～10%，1例约60%)。28例MEC均可见AB/PAS阳性的黏液细胞(图7)。

2.4 FISH检测28例MEC中17例检测出MAML2基因重排(图8)，11例检测阴性(图9)，检出率为60.7%(17/28)。17例MAML2基因重排中有14例低级别、3例中级别MEC，其中包含Warthin瘤样变异型和透明细胞变异型。另外，3例低级别、2例中级别及6例高级别MEC中，均未检测出MAML2基因重排。

2.5 涎腺MEC中MAML2基因重排与临床病理特征的关系MAML2基因重排与肿瘤部位相关，以腮腺部位阳性率最高(46.4%，13/28)，而非腮腺部位阳性率最低(21.4%，6/28)，两者差异有显著性(P<0.05)。本组结果显示：MAML2基因重排与病理分级相关，级别越低MAML2基因重排阳性率越高，两者差异有显著性(P<0.05)；MAML2基因重排与患者年龄、性别、肿瘤最大径、淋巴结转移及临床分期无相关性(P>0.05，表1)。

表1 涎腺MEC中MAML2基因重排与临床病理特征的关系

2.6 随访28例患者随访时间为2～60个月，有27例患者存活，包含1例术后复发，1例骨转移患者；1例患者因肿瘤转移死亡。存活的27例患者中16例检出MAML2基因重排，其中术后复发者也为阳性，11例阴性包括1例骨转移者。

3 讨论

3.1 临床病理特征MEC是儿童和年轻人最常见的原发性涎腺恶性肿瘤，患者平均发病年龄约45岁，肿瘤约一半发生在大涎腺(腮腺约占45%)，少数肿瘤位于小涎腺或鼻腔等部位，口腔内最常见的发病部位是腭和颊黏膜。MEC常见的临床症状多表现为实性、固定的无痛性肿块，还可以出现面神经麻痹、感觉异常、吞咽困难等症状。

尽管大多数涎腺原发的MEC在组织学上可以直接做出诊断，但其罕见的变异易引起误、漏诊，Fujimaki等[9]首次检测CRTC1-MAML2融合基因，确诊了嗜酸细胞变异型MEC。新近研究发现[10-11]，MEC还可出现纤毛变异型和Warthin瘤样变异型，FISH均检测出MAML2基因重排，而114例经典的Warthin瘤均未检测出MAML2基因重排。本组28例MEC中也发现1例Warthin瘤样组织学形态、MAML2基因重排，支持变异型MEC的诊断。本组还发现1例透明细胞变异型也检出MAML2基因重排，说明MAML2基因重排对MEC的诊断具有特异性。因此对于难以确诊的病例，行FISH检测MAML2基因重排有助于辅助诊断MEC的变异型。

目前大多数文献报道[1,4,7]MAML2基因重排在低级别MEC中发生率较高，概率为64.0%。本组MAML2基因重排在涎腺MEC的检出率为60.7%，MAML2基因重排与病理分级相关，级别越低MAML2基因重排阳性率越高。MAML2基因重排阳性与肿瘤部位相关，腮腺部位阳性率高，而非腮腺部位阳性率低。

3.2 分子遗传学特征染色体t(11;19)(q12;p13)易位重排是MEC特有的分子遗传学改变，该易位导致11号染色体上MAML2基因断裂重排，并与19号染色体上的CRTC1基因融合[1,12-13]。目前多数文献报道[1,4-7,9-12,14]通过FISH检测MAML2基因重排和实时荧光聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,qRT-PCR)法检测CRTC1/MAML2融合基因，两者的检测结果一致性较好[7,12]。MAML2基因重排阳性的MEC患者与阴性病例相比，表现出良好的临床病理特征：如患者年龄较轻、肿瘤较小，淋巴结转移频率、临床分期、组织学分级均较低，总生存期和无瘤生存期长[14]。

3.3 诊断及鉴别诊断大多数涎腺原发的MEC可以依据肿瘤的病理形态学特点和特征性的MAML2基因重排做出明确诊断，由于高级别MEC和一些罕见的变异型MEC与其他涎腺肿瘤在形态学上鉴别较困难，需与以下疾病进行鉴别。(1)腺鳞癌：分化程度较低，肿瘤细胞的异型性及多形性显著，核分裂象多见；MEC多数分化比较好，以表皮样细胞为主，其间可见少量黏液细胞，核分裂象一般少见。(2)非特异性透明细胞癌：特征是由单一的多边形细胞组成，且细胞质透明，一般无黏液细胞，肿瘤细胞PAS染色阳性，而AB染色阴性。文献报道透明细胞癌分子检测显示EWSR1-ATF1或EWSR1-CREM基因融合[15-16]，而透明细胞变异型MEC可见少量黏液细胞，AB染色阳性，本组1例透明细胞变异型MEC中MAML2基因重排检测阳性。(3)Warthin瘤伴囊性变及黏液细胞化生：Warthin瘤内层的上皮常发生黏液化生，但无细胞学上的异型性或侵袭性生长模式。相反，Warthin瘤样MEC无典型Warthin瘤的双层上皮，肿瘤细胞与典型的Warthin瘤中高柱状嗜酸性细胞相比，其矮而少[10]。文献报道，典型的Warthin瘤双层结构中管腔面内层上皮表达CK7，外围基底细胞表达p63。Warthin瘤样MEC的中间型细胞及表皮样则显示全层弥漫表达p63、CK5/6和CK7。FISH检测MAML2基因重排阳性可有助于诊断Warthin瘤样MEC[17-18]。

3.4 治疗与预后目前，手术切除仍是涎腺MEC的首选治疗方法，而术后放疗则主要用于高级别、晚期、不可切除和复发的MEC患者。近年文献报道，MEC的5、10年总生存率分别为83.1%和73.6%[19]。本组28例MEC均行肿瘤完整切除，有1例术后复发，1例骨转移，1例死亡，整体预后较好。MAML2基因重排的相关机制还需积累更多病例进行分析，寻找潜在的治疗靶点，为MEC的治疗提供新方向。