黄淅睿，杨承纲

乳腺癌是严重威胁我国女性生命健康的恶性肿瘤，而三阴型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是乳腺癌中极具侵袭性的一种亚型，占乳腺癌的10%～20%[1]。其复发、转移率高，由于具有高度侵袭性和较低的治疗反应，预后比其他乳腺癌亚型更差[2-3]。随着免疫治疗的不断进展，越来越多的肿瘤患者从中获益。研究表明，在许多癌症类型中程序性死亡-配体1(programmed cell death-ligand 1，PD-L1)的表达与更差的预后相关，表明PD-L1的分泌促进肿瘤逃避免疫系统[4]。目前PD-L1抑制剂(Atezolizumab)用于TNBC治疗的临床研究，评估PD-L1的表达在临床实践中的疗效预测价值日益凸显[5]。上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)是肿瘤恶性表型转化的启动过程，E-cadherin表达的缺失被认为是乳腺癌EMT发生的关键步骤，vimentin与细胞侵袭能力呈正相关，是EMT的晚期事件[6]。本文着重探讨TNBC中PD-L1和EMT标志蛋白分子的关系及其临床意义，为PD-L1用于TNBC的免疫治疗及预后评估提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年9月～2020年6月云南省肿瘤医院病理科存档的125例TNBC组织和50例癌旁组织，125例TNBC患者均为女性，年龄26～82岁，中位年龄50岁，>50岁者58例，≤50岁者67例，已绝经者61例，未绝经者64例，肿瘤直径≤2 cm者26例，>2 cm者99例，淋巴结转移者57例，发生远处转移者5例。病理组织学WHO分级Ⅰ级4例，Ⅱ级59例，Ⅲ级62例；CK5/6阳性者72例，阴性者53例；Ki-67增殖指数≤14%者17例，>14%者108例；TNBC患者按第8版AJCC乳腺癌分期系统分期，Ⅰ+Ⅱ期者99例，Ⅲ+Ⅳ期者26例。125例患者均有完整临床资料，病理类型均为浸润性导管癌，其中119例行手术切除，术前均未接受放、化疗、靶向治疗等。

1.2 试剂PD-L1(SP142)兔单克隆抗体购自Abcam公司，E-cadherin、vimentin兔抗人多克隆抗体均购自福州迈新公司，免疫组化检测试剂盒和DAB显色剂均购自福州迈新公司，PD-L1检测所需扩增增强二抗(Optiveiw)购自Roche公司。

1.3 免疫组化标本均经4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，切片4 μm厚。PD-L1抗体为浓缩液，按1 ∶100比例稀释，使用Ventana自动免疫组化染色平台，选择扁桃体组织作为阳性对照，PBS代替一抗作为阴性对照，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。E-cadherin、vimentin采用免疫组化色EnVision两步法染色，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。

1.4 结果判读

1.4.1PD-L1判读标准 在HE切片中评估肿瘤区域，纳入PD-L1评估范围的区域包括浸润性癌组织肿瘤内和瘤周间质中的免疫细胞，包括淋巴细胞、巨噬细胞、树突状细胞和粒细胞等(图1)，导管原位癌及肿瘤坏死区域不纳入评分范围。采用免疫细胞IC评分计算法：任何强度PD-L1染色的免疫细胞所占区域/肿瘤区域×100%。评分结果<1%为IC0，≥1%且<5%为IC1，≥5%且<10%为IC2，≥10%为IC3。免疫细胞染色区域占肿瘤区域≥1%(IC1、IC2、IC3)表示PD-L1阳性。此评分标准来源于IMpassion130研究设计，为FDA批准的首个采用免疫细胞评分计算PD-L1评分方法[7]。

图1 TNBC浸润性癌组织及分布在瘤内间质及瘤周间质中的淋巴细胞 图2 TNBC肿瘤浸润性免疫细胞中PD-L1呈阳性，Ventana法 图3 TNBC中E-cadherin呈阳性，EnVision两步法 图4 TNBC中vimentin呈阳性，EnVision两步法

1.4.2E-cadherin、vimentin判读标准 E-cadherin阳性细胞定位于细胞膜上含有黄色或暗褐色颗粒，vimentin阳性定位于细胞质。高倍镜下随机选取10个视野，按阳性细胞所占百分比及着色深浅进行结果判定。(1)按阳性细胞着色评分：不着色为0分，弱着色或淡黄色为1分，中等着色或棕黄色为2分，强着色或棕褐色为 3 分。(2)按阳性细胞百分比评分：阳性细胞<25%为1分，25%～50%为2 分，51%～75%为3分，>75%为4分。两项得分相加：0～4分为阴性，>4分为阳性。

1.5 统计学分析采用SPSS 25.0软件进行统计学分析，计量资料两组间行t检验，计数资料行χ2检验，采用Pearson列联系数对PD-L1表达与 EMT 标志蛋白的免疫组化结果行相关性分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 TNBC中PD-L1的表达PD-L1在正常乳腺组织中不表达，本组125例TNBC中，PD-L1在肿瘤浸润性免疫细胞中表达IC0 67例，IC1 27例，IC2 12例，IC3 19例，PD-L1在TNBC中的阳性率为46.40%(58/125)(图2)。

2.2 TNBC、癌旁组织中E-cadherin、vimentin的表达TNBC中E-cadherin呈阳性(图3)，阳性率为52.80%(66/125)；癌旁组织中E-cadherin呈阳性，阳性率为90.00%(45/50)；TNBC组织中的E-cadherin阳性率低于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=21.306，P<0.01)。TNBC组织中vimentin呈阳性(图4)，阳性率为41.60%(52/125)；癌旁组织中vimentin呈阳性，阳性率为16.00%(8/50)；TNBC组织中的阳性率高于癌旁组织，差异有统计学意义(χ2=10.388，P=0.001，表1)。

表1 TNBC、癌旁组织中E-cadherin、vimentin的表达 [n(%)]

2.3 TNBC中PD-L1与 E-cadherin、vimentin表达的相关性本组结果显示，TNBC中PD-L1与E-cadherin蛋白呈负相关(χ2=17.440，P<0.01)；PD-L1与vimentin蛋白表达呈正相关(χ2=6.253，P=0. 012，表2)。

表2 TNBC中PD-L1与E-cadherin、vimentin表达的相关性

2.4 TNBC中PD-L1、E-cadherin、vimentin表达与临床病理特征的关系本组结果显示：PD-L1、E-cadherin、vimentin的表达与淋巴结转移、Ki-67增殖指数、组织学分级有关(P<0.05)；与患者年龄、月经状态、肿瘤大小、远处转移、TNM分期均无关(P>0.05，表3)。本组依据TNBC中CK5/6表达分为基底细胞亚型及非基底细胞亚型，PD-L1在两者中的表达差异无统计学意义(P>0.05)。

表3 TNBC中PD-L1、E-cadherin、vimentin表达与临床病理特征的关系

3 讨论

PD-L1是程序性死亡因子-1(programmed cell death-1, PD-1)的配体之一，在多种肿瘤中表达，PD-L1与肿瘤浸润淋巴细胞表面的受体PD-1结合，可抑制T细胞迁移、增殖及分泌细胞毒性介质，从而阻断抗肿瘤免疫应答[8]，PD-L1在TNBC患者中过表达，尽管其机制尚不清楚，但已被认为与更强的侵袭力和较差的预后有关[9-10]。靶向PD-1/PD-L1途径可能阻止抑制性T细胞信号转导过程，并重新激活T细胞介导肿瘤杀伤功能，从而增强抗肿瘤免疫效应[11]。随着免疫治疗研究的不断推进，目前全球已有5种PD-1/PD-L1抑制剂获批上市。近年研究发现，针对PD-L1的单克隆抗体Atezolizumab安全、可耐受，在TNBC中显示持续的抗肿瘤效果[12-13]。因此，PD-L1(SP142)作为Atezolizumab的伴随诊断，检测其在TNBC中的表达对临床治疗的意义日益显著。本组PD-L1在TNBC中的阳性率为46.4%(88/125)，PD-L1的表达与淋巴结转移、Ki-67增殖指数、组织学分级有关(P<0.05)，可证实TNBC中PD-L1参与免疫细胞的抗肿瘤免疫效应。本组结果显示PD-L1与TNBC临床分期及远处转移无相关性(P>0.05)，与PD-L1的表达促进肿瘤的侵袭、转移的结论相悖，可能与本组Ⅲ、Ⅳ期TNBC病例量较少有关：(1)当代女性的健康意识广泛提高，体检意识增强，肿瘤的早发现、早治疗得到了更好的实施；(2)随着新辅助化疗的广泛应用，越来越多的晚期乳腺癌患者术前接受新辅助化疗缩小肿瘤、延缓肿瘤进展，从而获得手术机会。

EMT是肿瘤细胞突破基膜获得侵袭及转移能力的第一步。EMT过程对肿瘤细胞骨架排列变化起促进作用[14]，使细胞的黏附功能降低，原发病灶中的细胞更容易脱离，从而侵袭或转移到周围或远处组织[15]。E-cadherin是典型的上皮细胞标志物，对维持细胞间黏附和个体上皮的完整起关键作用，与肿瘤的浸润、侵袭能力呈负相关[16]。vimentin是间质细胞的标志物，可维持间质细胞特性，与细胞侵袭能力呈正相关。当肿瘤细胞发生EMT时，E-cadherin表达减少，角蛋白为主的细胞骨架转变为vimentin为主的细胞骨架，从而引起细胞形态发生变化[17-18]，使肿瘤细胞摆脱细胞间的连接，并更具侵袭性，因此部分TNBC细胞因发生EMT呈间质表型[19]。本组癌组织中E-cadherin的阳性率明显低于癌旁组织，而vimentin的阳性率显著高于癌旁组织，且E-cadherin和vimentin的表达均与与淋巴结转移、Ki-67增殖指数、组织学分级有关(P<0.05)，与以往研究报道中随着肿瘤的发展呈E-cadherin表达降低，而vimentin表达增高的结果相符。实验显示TNBC中E-cadherin和vimentin的表达与远处转移及临床分期无关，与文献报道有差异，可能与本组晚期TNBC病例数少有关。

已有研究表明，在多种肿瘤中PD-L1的表达水平与EMT呈正相关。Asgarova等[20]证实在肺癌中EMT被TNF-α/TGF-β1诱导，并伴随PD-L1的表达水平增加，提示可以通过DNA甲基化和NF-κB信号同时控制PD-L1的表达。Alsuliman等[21]的实验中，使用EMT转录因子Snail在乳腺癌细胞中诱导EMT，促进癌细胞逃避CD8+毒性T细胞介导的T细胞裂解过程，支持EMT在乳腺癌细胞免疫逃逸中的作用，且证明EMT诱导的PD-L1上调是依赖PI3K/AKT和ERK/MEK途径，表明EMT状态是乳腺癌细胞PD-L1表达的重要调节因子。部分学者提出EMT还通过肿瘤逃避免疫监视的机制促进癌症进展[22]，间充质细胞被证明能够诱导调节性T细胞，在体外和体内通过TSP1的产生损害树突状细胞，并逃避T细胞介导的裂解；免疫组化标记如CD8+T细胞可以刺激乳腺癌细胞进行EMT[23]。当前各项研究表明PD-L1的表达及EMT均可促进肿瘤细胞的浸润和迁移，并且靶向PD-1/PD-L1途径将逆转肿瘤细胞中的EMT[24]。本实验可见TNBC中PD-L1与E-cadherin蛋白呈负相关，与vimentin表达呈正相关，可初步证实PD-L1的表达在发生EMT时上调，与文献报道相符。EMT通过改变肿瘤细胞的表型进而增加侵袭能力，由此猜测在EMT过程中各种调控因子可通过促进PD-L1 的表达，促进肿瘤细胞的免疫逃逸。

综上所述，PD-L1在TNBC中呈异常高表达，与癌细胞EMT表型有关，其具体调控机制还有待更深入的分析。目前TNBC治疗手段较局限，虽然对化疗敏感，但短期内易出现复发转移，因此寻找TNBC有效的治疗手段具有重要临床意义。靶向PD1/PD-L1途径将可能成为更精准抗击肿瘤的策略，2019年Atezolizumab经批准可联合化疗用于无法切除的局部晚期或转移性TNBC患者，因此检测TNBC中PD-L1的表达有益于为免疫治疗的应用奠定基础，且联合评估TNBC中的PD-L1表达水平与EMT状态可为探索肿瘤发展过程及判断肿瘤的预后提供依据。