刘 辉，杨菁茹，李元朋，蔡凤梅，任雨洁，侯梦晨，夏益敏，王卉芳

三阴型乳腺癌(triple-negative breast cancer, TNBC)是指雌激素受体(estrogen receptor, ER)、孕激素受体(progesterone receptor, PR)及人表皮生长因子受体-2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)均阴性的乳腺癌，由于其对内分泌治疗及靶向治疗均不敏感，患者临床治疗预后差，迫切需要寻求新的有效治疗措施。近年随着黑色素瘤优先表达抗原(preferentially expressed antigen of melanoma, PRAME)及程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1, PD-L1)[1-5]等免疫治疗不断发展，免疫检查点抑制剂相关药物已获批用于黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌等实体性肿瘤的治疗，也为TNBC患者的治疗带来希望。本文着重探讨PRAME和PD-L1在TNBC中的表达，为TNBC患者的免疫治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料收集2005年5月～2020年5月陕西省西安市第四医院外科手术切除的乳腺癌标本260例，所有病例均未行放、化疗或其他针对肿瘤的治疗，其中TNBC 46例，非TNBC 214例；另收集50例正常乳腺组织作为对照。

1.2 免疫组化每例选取2个具有代表性的区域制作组织芯片，每个微孔直径均为2 mm。

免疫组化染色采用EnVision法，一抗PRAME(兔单克隆抗体，克隆号EPR20330，稀释比1 ∶1 000)和PD-L1(兔多克隆抗体，克隆号28-8，稀释比1 ∶100)购自美国Abcam公司。ER、PR、HER-2和Ki-67等，均购自福州迈新公司。具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。标本均由两位经验丰富的病理医师重新阅片，并依据WHO(2014)乳腺肿瘤分类标准进行分类分级。

1.3 结果判断PRAME以细胞核着色为阳性；PD-L1以肿瘤部分或全部细胞膜着色，阳性细胞数≥ 1%判定为阳性，不计免疫细胞数量。

1.4 统计学分析采用SPSS 22.0软件进行统计学分析。计数资料采用[n(%)]表示；组间总体分布趋势比较，采用χ2检验及Fisher精确概率法；两两比较采用Bonferrion矫正法；以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 临床特点46例TNBC患者年龄36～78岁，平均49岁，肿瘤最大径0.6～4.8 cm，平均2.6 cm，有淋巴结转移者37例；214例非TNBC患者年龄为28～75岁，平均41岁，肿瘤最大径0.8～5.8 cm，平均3.2 cm，有淋巴结转移者32例。

2.2 不同乳腺组织中PRAME的表达TNBC细胞多呈巢状排列(图1)，PRAME在TNBC组织中呈弥漫阳性(图2)；非TNBC细胞呈巢状或条索状排列，间质中可见淋巴细胞浸润(图3)，PRAME在非TNBC组织中呈弥漫阳性(图4)。PRAME在TNBC组和非TNBC组中的阳性率分别为38.8%和41.3%，差异无显著性(P>0.05)。PRAME在乳腺癌组和非乳腺癌组中的阳性率分别为39.2%和0，差异有显著性(P<0.01)。PRAME在TNBC组和非TNBC组中的阳性率与非乳腺癌组相比，差异均有显著性(P<0.01)。PRAME在乳腺癌中的表达与肿瘤大小、淋巴结转移无相关性，TNBC组及非TNBC组中PRAME的表达与肿瘤大小、淋巴结转移均无相关性。

图1 TNBC细胞呈巢状排列伴坏死 图2 TNBC中PRAME呈胞核弥漫阳性，EnVision法 图3 非TNBC细胞呈巢状及条索状排列，间质中见淋巴细胞浸润 图4 非TNBC中PRAME呈胞核阳性，EnVision法 图5 TNBC细胞呈小巢状排列 图6 TNBC细胞中PD-L1呈阳性，EnVision法

2.3 不同乳腺组织中PD-L1的表达TNBC细胞呈小巢状排列(图5)， PD-L1在TNBC的肿瘤细胞中呈阳性(图6)，PD-L1在TNBC和非TNBC组中的阳性率分别为37.0%和25.0%，差异有显著性(P<0.05)。PD-L1在乳腺癌组及非乳腺癌组中的阳性率分别为27.3%和0，差异有显著性(P<0.01)。PD-L1在TNBC组和非TNBC组中的阳性率与非乳腺癌组相比，差异均有显著性(P<0.01)。PD-L1在乳腺癌中的表达与淋巴结转移呈正相关，与肿瘤大小无相关性，其中TNBC组和非TNBC组中PD-L1的表达与淋巴结转移均呈正相关，与肿瘤大小均无相关性。

3 讨论

TNBC患者复发及转移率高，对内分泌及靶向治疗均不敏感，患者预后差，急需寻求新的有效治疗方案。随着免疫治疗相关靶点如PRAME和PD-L1等临床研究的开展，相关药物相继用于黑色素瘤、非小细胞肺癌和肾细胞癌等实体性肿瘤的治疗，并取得较为满意的疗效，也为TNBC患者的治疗带来希望。目前，PRAME和PD-L1在TNBC中的研究尚存在争议，特别是不同克隆号的PD-L1试剂盒存在实验平台及判读标准的不一致，导致实验结果的差异性。本实验分析PRAME及PD-L1在TNBC中的表达，为TNBC患者的免疫治疗提供参考。

PRAME是肿瘤-睾丸抗原(cancer testis antigen, CTA)家族成员之一，最早由Ikeda从黑色素瘤细胞中分离而出，能够被HLA-A24分子递呈给细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocytes, CTL)。PRAME在正常组织中的表达仅限于睾丸、卵巢和肾上腺等，其是具有免疫原性的肿瘤相关抗原，在大多数血液系统恶性肿瘤及实体瘤中异常高表达[6-11]，在正常组织中表达的局限性及在肿瘤组织中的高表达，被认为是肿瘤免疫治疗理想的靶标。目前，PRAME在TNBC中的表达报道较少，具体机制尚不清楚。Al-Khadairi 等[12]研究结果显示，PRAME可以上调TNBC细胞中SNAI1/TCF4/TWIST1、FOXC2、IL1RN、MMP2、SOX10、WNT11、MMP3、PDGFRB和JAG1等基因及E-cadherin、N-cadherin、vimentin和ZEB1蛋白表达升高，从而促进TNBC细胞的侵袭和转移； Epping等[13]观察295例乳腺癌中PRAME的表达，发现其与乳腺癌远处转移及患者的不良预后呈正相关，可作为乳腺癌不良预后的指标。Doolan等[14]报道结果亦显示在103例乳腺癌患者中，PRAME的表达与患者无瘤生存期低及不良预后呈正相关。Sun等[15]报道PRAME可以抑制乳腺癌细胞的增殖和转移，下调PRAME的表达可以促进乳腺癌细胞增殖并抑制其凋亡；即使在不同分型乳腺癌组织中PRAME的表达差异性也存在争议，Curigliano等[16]报道PRAME和NY-ESO-1的CTA家族在不同分子分型的乳腺癌的增殖中表达，发现NY-ESO-1在TNBC中高表达，而PRAME在HER-2阳性的乳腺癌中阳性率为16%，在TNBC中呈阴性。Tessari 等[17]报道CTA家族中PRAME、MAGE-A3和NY-ESO-1在不同分子分型乳腺癌组织中的表达，发现NY-ESO-1在TNBC组及非TNBC组间表达差异有显著性，而PRAME和MAGE-A3在各组乳腺癌中表达差异无显著性；PRAME在各组乳腺癌中的阳性率达85.7%～96.6%，在TNBC中的阳性率为85.7%，但未与正常乳腺组织进行对比分析。本实验不仅分析了乳腺癌与正常乳腺组织中PRAME的表达差异，同时也分析了TNBC组与非TNBC组间PRAME表达的差异。本实验结果显示，PRAME在TNBC组和非TNBC组中的阳性率分别为38.8%和41.3%，均高于正常乳腺组织，可作为乳腺癌免疫治疗的靶点，但两组之间差异无显著性，TNBC及非TNBC组中PRAME的表达与淋巴结转移均无相关性。

PD-L1是B7家族的跨膜蛋白，广泛表达于免疫细胞、上皮细胞及血管内皮细胞。PD-L1与PD-1结合后，下调淋巴细胞增殖及相关细胞因子产生，诱导免疫耐受，肿瘤细胞高表达PD-L1后利用该机制从而逃避免疫监视，利用抗PD-1/PD-L1抗体阻断PD-1/PD-L1途径可以达到抗肿瘤效果。随着以PD-1/PD-L1为靶点的免疫治疗在非小细胞肺癌及恶性黑色素瘤等肿瘤治疗中的应用，其在乳腺癌特别是TNBC治疗的研究广泛开展。国外报道多集中于PD-L1在TNBC中的表达及其与预后的相关性，但由于检测平台、所用抗体及评判阈值的差异性，导致实验结果不一致。Dill等[18]检测245例原发性乳腺癌(其中32%为TNBC)及40例转移性乳腺癌中PD-L1(克隆号SP142)的表达，结果显示PD-L1在高级别乳腺癌及TNBC中阳性率更高；Rugo等[19]应用SP142、22C3和SP263三个不同克隆号的PD-L1抗体对614例TNBC进行检测，结果显示阳性率分别为46%、81%和75%；黄述斌等[20]报道PD-L1(克隆号SP142)在乳腺癌组织中的阳性率为35.3%，在TNBC中的阳性率为61.9%，明显高于非TNBC组。目前，PD-L1表达与预后的相关性研究存在争议。Muenst 等[21]发现乳腺癌中PD-L1的表达与患者年龄、肿瘤大小、分期分级及淋巴结转移有相关性。Monneur等[22]也认为PD-L1表达与不良预后相关，特别是在TNBC及基底细胞亚型中阳性率更高。文献报道[23-24]PD-L1表达是乳腺癌患者预后的积极因素。现阶段PD-L1不同克隆号采用的不同检测平台及评判标准，导致结论可能存在差异。本实验采用PD-L1(克隆号28-8)抗体，结果显示其在TNBC及非TNBC中的阳性率分别为37%和25%，在乳腺癌及正常乳腺组织中的阳性率分别为27.3%和0，在乳腺癌中的表达与淋巴结转移及病理分级呈正相关。尽管PD-L1的表达尚存争议，但并不影响抗PD-L1药物在乳腺癌特别是TNBC治疗中的临床研究。抗PD-L1药物临床研究集中在Atezolizumab、Avelumab和Durvalumab，研究显示虽然抗PD-1/ PD-L1药物对TNBC具有一定缓解作用，但其作用并不理想，应进行免疫治疗联合放、化疗等治疗方案，以期获得更好的疗效。文献报道[25-29]显示，联合免疫治疗、放化疗比单独应用免疫治疗能够获得更高的肿瘤缓解率，死亡风险明显降低。

综上所述，以PRAME和PD-L1等靶点的免疫治疗为TNBC的治疗带来新希望。目前，其作用机制尚不清楚。不同克隆号PD-L1采用的检测平台及结果评判标准存在差异，导致分析结果有差异，免疫治疗联合放疗或化疗能够显著提高患者的肿瘤缓解率。另外，还需积累更多病例进一步分析其最佳的联合治疗方案及降低患者不良反应。