王浩 陈群超 殷丽丽

【摘 要】目的：探究不同退变阶段骨关节炎自噬因子ULK1、Beclin1和LC3B在软骨细胞中的表达。方法：根据Kellgren-Lawrence影像学诊断标准，收集正常软骨样品，中期、晚期骨关节炎软骨样品;体外分离、培养软骨细胞，甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原免疫组化染色用于鉴定软骨细胞，运用荧光定量PCR及WB技术分别从mRNA及蛋白水平检测ULK1、Beclin1和LC3B的表达。结果：甲苯胺蓝染色显示，软骨细胞核为深蓝色，胞质中有大量异色蓝紫色颗粒。胶原蛋白的免疫荧光染色显示，细胞外基质为棕色，细胞核染为黄褐色。荧光定量PCR及WB结果显示，正常软骨细胞中ULK1、Beclin1、LC3B mRNA及蛋白水平稳定表达，随着骨关节炎程度加重，其表达量逐渐减少，细胞中表达量最低的是晚期骨关节炎组，3组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论：随着骨关节炎的加重，软骨细胞自噬相关因子的表达降低。自噬是维持正常软骨细胞稳态的保护机制，对调控骨关节炎的发展有重要的作用。

【关键词】 骨关节炎;软骨细胞;自噬;退变

Study on the Expression of Autophagy in Osteoarthritis Chondrocyte Degeneration

WANG Hao，CHEN qun-chao，YIN Li-li

【ABSTRACT】Objective：To investigate the expressions of autophagy factors ULK1，Beclin1 and LC3B in chondrocytes of osteoarthritis at different stages of degeneration.Methods：According to the Kellgren-Lawrence imaging diagnostic criteria，normal cartilage samples，mid-term and late osteoarthritis cartilage samples were collected.Chondrocytes were isolated and cultured in vitro;toluidine blue and typeⅡ collagen immunohistochemical staining were used to identify chondrocytes;and the expressions of ULK1，Beclin1 and LC3B were detected by fluorescent quantitative PCR and WB Technology respectively from mRNA and protein levels.Results：Toluidine blue staining showed that the nucleus of cartilage was dark blue，and there were a large number of heterochromatic blue purple granules in the cytoplasm.Immunofluorescence staining of collagen showed that the extracellular matrix was brown and the nucleus was yellowish brown.The results of fluorescence quantitative PCR and WB showed that ULK1，Beclin1 and LC3B were stably expressed in normal chondrocytes at mRNA and protein levels.With the aggravation of osteoarthritis，the expression level gradually decreased.The lowest expression level was in the advanced osteoarthritis group，and the difference was statistically significant

（P < 0.05）.Conclusion：With the aggravation of osteoarthritis，the expression of autophagy related factors in chondrocytes decreased.Autophagy is a protective mechanism to maintain normal chondrocyte homeostasis，and plays an important role in regulating the development of osteoarthritis.

【Keywords】 osteoarthritis;chondroc-yte;autophagy;degeneration

骨關节炎（osteoarthritis，OA）是一种慢性关节疾病，多发生于50岁以上的中老年人，女性发病率高于男性。软骨细胞的减少和软骨基质的降解是OA形成的主要病理变化，其中软骨细胞稳态失衡起着重要的作用[1-2]。在OA的发展过程中，受损的细胞器和降解的大分子物质逐渐积聚在软骨细胞中，破坏了软骨细胞的平衡，细胞合成、分解代谢失衡，导致软骨细胞功能异常，生存能力下降，细胞外基质合成能力下降，从而加速软骨细胞的退变[3]。

自噬（Autophagy）是细胞自我降解并循环利用细胞内组分的过程，在维持细胞环境平衡和提高细胞存活率方面发挥着重要作用[4]。许多疾病的发生和进展都与自噬相关，它是自噬相关基因（Atg）参与介导的蛋白质加工修饰过程，其中Atg1、Atg6、Atg8（哺乳动物中的同源物分别称作ULK1、Beclin1、LC3B）分别起到诱导者、调节者、执行者的作用[5-6]。如果可以找到调控OA软骨细胞稳态平衡的机制，维持软骨细胞合成、分解代谢平衡，将对治疗OA有重要意义。因此，本研究使用人膝OA软骨细胞，探究自噬在OA软骨细胞退变中的作用，能够为采用药物治疗OA提供理论和实验基础。

1 材 料

1.1 病例来源 根据Kellgren-Lawrence影像学诊断标准[7]，从苏州市立医院手术室进行膝关节截肢或置换术的患者中，取正常对照组5个软骨样品，中期、晚期OA组各10个软骨样品。本研究通过苏州市立医院伦理委员会的批准和授权，伦理审查编号为KL901126。患者均知情并签署同意书。

1.2 主要试剂 DMEM高糖培养基、胎牛血清（FBS）、质量分数为0.25%的胰蛋白酶溶液、

Ⅱ型胶原酶（美国Hycolon公司）;TRIzol试剂、Taq PCR反应试剂盒（中国大连宝生物公司）;dNTP Promega、逆转录试剂盒（加拿大Fermentas公司）;抗ULK1（生产批号ab133747）、抗Beclin1（生产批号ab55878）、抗LC3B（生产批号ab48394，英国Abcam公司）。引物：自噬相关基因ULK1、Beclin1、LC3B及内参β-actin引物均由上海生工生物工程有限公司设计合成。

2 方 法

2.1 软骨细胞分离与培养 从手术室获取的标本，用生理盐水反复冲洗，转移至盛有DMEM培养基的离心管中，在低温条件下尽快转运至实验室进行细胞分离。在超净工作台内，将正常软骨，中期、晚期OA软骨标本用组织剪尽量剪成小于1 mm3的小块软骨。在物理消化的基础上，以质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化20 min，PBS溶液清洗后加入含质量分数为0.2%Ⅱ型胶原酶的DMEM低糖培养基，置于37 ℃水浴箱中轻微震荡消化30～40 min，加入胎牛血清终止消化，离心机以1000 r·min-1离心5 min，离心半径6 cm，弃上清，即得到消化后的软骨细胞。将上述获得的软骨细胞接种于10 cm培养皿中，置于37 ℃恒温、体积分数为5%的CO2及饱和湿度的孵箱中培养，定期更换培养液。

2.2 倒置显微镜下观察并绘制生长曲线 倒置显微镜下观察不同时期软骨细胞的形态、黏附、生长特性和密度，MTT比色法绘制细胞生长曲线，监测细胞增殖。

2.3 细胞爬片制作 将经过处理后的盖玻片放在6孔板中，以1×104·mL-1，每孔2 mL的密度在6孔板中接种第2代软骨细胞，将其置于37 ℃的培养箱中，并以体积分数5%的CO2进行培养;当盖玻片上软骨细胞的融合率达到约80%时，用PBS溶液洗涤3次，用质量分数为4%的多聚甲醛固定30 min，然后用双蒸馏水洗涤3次。

2.4 软骨细胞爬片甲苯胺蓝染色 将细胞玻片放在染色架上，加入适量质量分数为1%的甲苯胺蓝染料溶液，并在室温下染色30 min;用双蒸水洗去多余的染料溶液;用水和无水乙醇梯度干燥，每次约2 min;安装后使用中性树胶，并使用倒置显微镜进行观察和记录。

2.5 软骨细胞爬片Ⅱ型胶原免疫组化染色 将细胞玻片放在染色架上，并与未接种的动物血清在室温下孵育10 min;使用1∶100的兔抗人Ⅱ型胶原蛋白抗体，4 ℃过夜;用PSB溶液加温后在37 ℃冲洗45 min，加入滴滴标记的二抗生物素，在室温下孵育10 min;DAB显色5～10 min，苏木精染色2 min，盐酸酒精辨别;用双蒸馏水轻轻冲洗10～15 min;用无水乙醇和中性胶干燥，并用倒置显微镜观察和捕获图像进行记录。

2.6 荧光定量PCR检测 将细胞接种到板中的软骨细胞中，通过三唑法从软骨细胞中提取RNA，并通过DNA蛋白质分析仪的凝胶电泳确定RNA的含量和纯度，以及RNA片段的完整性。逆转录试剂盒用于将RNA逆转录为cDNA，PCR试剂盒用于检测人ULK1、Beclin1及LC3B mRNA，ACTB（β-actin）用作基因内部参考。使用2-ΔΔCT方法分析相应的基因表达，并为每个样品定义3个重复样品。引物序列见表1。

2.7 Western blot 检测 使用预冷的软骨细胞蛋白提取物进行总蛋白提取;使用BCA方法确定蛋白质浓度;SDS-PAGE电泳;确定作为目标蛋白质体积大小的转移时间，转移后迅速除去膜并在TBST溶液中洗涤3 min，然后将溶液封闭1 h;在室温下将一抗孵育2 h，然后用TBST洗涤膜;将二抗孵育2 h，每次用TBST清洗膜10 min，共3次，然后添加ECL显色溶液进行曝光和显影。使用Image J软件分析目标蛋白质范围的灰度值，并使用内部对照进行半定量分析。

2.8 统计学方法 采用SPSS V25软件进行统计分析。计量资料以表示，2组比较采用t检验，多组比较采用单向方差分析。成对比较通过SNK方法在多个组中进行测试;如果方差是不规则的，或者组间的均值差异很小，则可以将Kruska l -Wallis

秩和检验用于多个独立样本。以P < 0.05为差异有统计学意义。

3 结 果

3.1 原代软骨细胞倒置相差显微镜观察 在倒置相差显微镜下，可以观察到原代正常软骨细胞是球形的，大小均匀。培养8～12 h后，细胞开始黏附在壁上。附着后，软骨细胞表现为短梭形。2～

3 d后，扩展为多边形。扩散很明顯，可以看到成簇，并且在部分区域软骨细胞呈集落生长。第1代细胞贴壁时间缩短，增殖速度加快，见图1;第2代和第3代软骨细胞的生长速度快于第1代，而第4代软骨细胞生长缓慢。

3.2 软骨细胞生长曲线 为了监测软骨细胞的增殖，笔者使用MTT比色法绘制细胞生长曲线。第2代正常软骨细胞经培养后，增殖在前5 d缓慢，5～7 d加速，7～9 d显著增加，9～11 d增殖趋缓。随着传代次数的增加，软骨细胞增殖的顶点变得越来越少，速度越来越慢。见图2。

3.3 软骨细胞的鉴定 为了在体外鉴定分离的软骨细胞，笔者在原代软骨细胞切片上进行了甲苯胺蓝染色，并用免疫组化检测软骨细胞标志物Ⅱ型胶原表达。

用甲苯胺藍将软骨细胞染色，并在倒置显微镜下观察。细胞核为深蓝色，胞质为蓝紫色，可见1～

2个细胞核，染色阳性，见图3;化学染色后的Ⅱ型

胶原免疫染色组，细胞质和细胞膜为黄棕色，染色较深，细胞核未染色，细胞核为黄褐色，在细胞周围可见黄褐色颗粒，染色呈阳性表现，见图4。

3.4 不同退变阶段OA软骨细胞中自噬相关基因的表达变化 在正常软骨细胞中，可以检测到自噬相关基因ULK1、Beclin1及LC3B稳定表达，随着OA程度加重，其表达量逐渐降低，表达量最低的是晚期OA组软骨细胞，3组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2。

3.5 不同退变阶段OA软骨细胞中自噬相关蛋白的表达变化 通过蛋白质印迹法检测自噬相关蛋白表达的进一步变化，结果见图5。检测正常软骨细胞时，发现自噬相关基因ULK1、Beclin1及LC3B稳定表达，随OA程度加重，其表达量逐渐减少，其中，表达量最低的是晚期OA组软骨细胞，3组间比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

4 讨 论

OA是一种退行性疾病，会导致软骨、软骨下骨和滑膜乃至整个关节软骨退行性改变。关节软骨由少量的软骨细胞和丰富的细胞外基质构成。在维持代谢稳态和细胞外基质的结构完整性中，软骨细胞的正常功能状态起着重要作用[8];因此，软骨细胞在关节软骨的发育形成、退变中扮演着重要角色。

自噬可以不断降解细胞器和破坏大分子物质，这是细胞的自我保护机制。自噬在软骨细胞的成熟和稳态中也起着重要作用。

本研究中，定量荧光PCR和Western blot技术分别从mRNA和蛋白水平揭示了与自噬相关因子的定量表达及其与OA的关系。研究发现，与自噬相关的基因和蛋白质在正常软骨细胞中稳定表达，随着OA的进展，其表达量逐渐降低，提示自噬能够维持正常软骨细胞代谢平衡，是正常软骨细胞的保护机制。当软骨细胞受损时，自噬作用被抑制，进一步加速了OA的进程。与CARAM?S等[9-10]研究结果一致。

SASAKI等[11]报道，与正常软骨细胞相比，早期OA软骨细胞中Beclin1、LC3B mRNA及蛋白表达上调，而晚期OA软骨中，Beclin1、LC3B mRNA及蛋白表达则下调。根据上述研究结果，笔者推测，在OA早期，自噬作为恢复软骨细胞稳态的最初尝试，为了保护软骨细胞稳态平衡，其表达将增加。如果高强度破坏性因子继续影响软骨细胞，自噬不堪重负，自噬活性下降，凋亡活动增强。因此，在晚期OA软骨中，自噬活性下降。此外，SASAKI等[11]用一氧化氮、白细胞介素-1刺激软骨细胞，发现软骨细胞自噬表达增强，这也验证了笔者的假设，进一步说明至少在软骨细胞退变的初始阶段，自噬表达增强。

本研究针对不同退变阶段OA软骨细胞中自噬相关因子的表达变化规律进行了初步探讨，发现自噬在OA软骨及软骨细胞退变过程中具有重要的调控作用。在OA引起的各种病理学因素的刺激下，软骨细胞首先反应性上调自噬相关因子，促进软骨细胞生存。但是，随着损伤性因素的持续存在以及不断增强，自噬水平降低，并导致软骨内细胞凋亡，最终导致OA的发生、进展。

参考文献

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收稿日期：2020-12-03;修回日期：2021-01-19