许 磊,焦思明,张文昌,程 功,孙家言,赵 岩,*,张劲松,*

(1.中国科学院金属研究所沈阳材料科学国家研究中心,辽宁沈阳 110016; 2.中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室,北京 100190)

低分子量壳聚糖(low molecular weight chitosan)和壳寡糖(chitooligosaccharides,COS)是一类具有抗菌[1-2]、调节免疫[3-4]、抗肿瘤[5-6]、诱导植物抗病抗逆与促进植物生长[7-8]等多种生物活性的生物材料[9-11],通常由壳聚糖(chitosan,CS)降解制备,具有良好的应用前景。目前较低的生产效率和制备成本限制了它们的广泛应用。壳聚糖的降解通常包括氧化降解、酶降解和酸降解等方法[12-13]。壳聚糖氧化降解中较为常用的氧化剂是过氧化氢[14-15],但其降解产物的糖单元的结构会发生变化[16]。酶降解是一种较为常用的壳聚糖降解方法,通常将壳聚糖用稀酸溶解后添加适量的酶进行降解反应[17-19]。壳聚糖本身是一种高分子,溶解后会产生一定的粘度,其粘度随着浓度的增大而增大。当壳聚糖溶液粘度过大时,酶降解难以顺利进行,因此酶降解反应壳聚糖底物的浓度通常为2.0%(2.5%左右,限制了壳寡糖单位时间内的产能。

酸降解也是一种较为常用的壳聚糖降解方法,一般是将壳聚糖用稀酸溶解后,以“匀相”的方式进行降解[20-21],目前存在收率低,反应时间长和废液排放等问题。Osorio-Madrazo研究了壳聚糖在固相条件下进行酸降解[22-23],与壳聚糖“匀相”酸降解相比,固相酸降解具有反应时间短、后处理简单、降低废液排放等优点,但由于常规加热方法难以实现对固相反应体系的快速均匀加热,使得壳聚糖的固相降解反应过程难以控制。

微波是一种电磁波,可以实现对材料的选择性加热,强化化学反应过程,大幅提高反应速率。微波降解壳聚糖已有研究,Jaroslaw认为微波提高降解反应速率的机理是微波引起分子振荡产生剪切力导致聚合物主链断裂[24],Chen和Xing在研究壳聚糖微波降解时使用离子液体[25]、无机盐[26]等作为添加剂,他们认为微波提高降解反应速率的机理是微波与添加剂的相互作用产生过热效应。微波加热酶降解壳聚糖制备壳寡糖的研究[27-28]也有相关报道。这些方法均是以“匀相”方式进行,壳聚糖在微波强化下的固相酸降解还未有报道。

针对常规加热方法壳聚糖固相酸降解过程中物料难以快速均匀加热的问题,本文研究了微波强化下的壳聚糖固相酸降解反应。利用微波对材料的选择性加热特点,开发出一种高效制备低分子量壳聚糖和壳寡糖的方法,有助于低分子量壳聚糖和壳寡糖的广泛应用。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

壳聚糖 脱乙酰度=85%,扬州日兴生物科技有限公司;壳聚糖酶APCSN(酶活力:2500 U/g) 中国科学院过程工程研究所提供;系列分子量右旋糖酐(峰位分子量Mp=180、9750、36800、135350、300600、2000000) 中国食品药品检定研究所;其他试剂 均为AR级。

微波反应器 实验室自制,其示意图见图1,反应釜外壁为不锈钢,内衬为聚四氟乙烯,微波发射频率为2450 Hz;LC-20A高效液相色谱仪(配有LC-20AT恒流泵、CTO-20A柱温箱、RID-10A示差检测器) 日本Shimadzu公司;Agilent Technologies Cary 630 spectrometer傅立叶变换红外光谱仪 美国Agilent公司;Bruker 600 MHz UltraShieldTM核磁共振仪 瑞士Bruker公司;TSQ Quantum Access Max质谱仪 美国Thermo Scientific公司;NDG-5型数显粘度计 上海顺宇恒平科学仪器有限公司。

图1 微波反应器示意图Fig.1 Schematic diagram of microwave reactor

1.2 实验方法

1.2.1 反应参数对微波强化壳聚糖固相酸降解的影响

1.2.1.1 微波辐射功率 称取30 g壳聚糖置于微波反应器的反应釜中,缓慢加入15 mL 12 mol/L盐酸,搅拌均匀后物料用微波加热。微波辐射功率分别为10、20、30、40、50 W,辐照时间为4 min。反应结束后,物料用无水乙醇洗涤两次,4000 r/min离心5 min,60 ℃真空干燥24 h,得到降解产物(总共5组反应,得到5份降解产物,分别编号为W10、W20、W30、W40、W50)。

1.2.1.2 盐酸用量 称取30 g壳聚糖置于微波反应器反应釜中,缓慢加入不同剂量的12 mol/L盐酸(分别为12、15、18 mL,即壳聚糖/盐酸的质量体积比为5∶2、2∶1、5∶3),搅拌均匀后物料用微波加热。微波辐射功率为20 W,辐射时间依次为4、7、10、15、20 min。反应结束后,物料用无水乙醇洗涤两次,4000 r/min离心5 min,60 ℃真空干燥24 h,得到降解产物(总共15组反应,得到15份降解产物,分别编号为CS12-4～CS12-20、CS15-4～CS15-20、CS18-4～CS18-20)。

1.2.2 降解产物的GPC(凝胶渗透色谱)分析 称取上述制备的降解产物各10 mg,用1 mL 0.1 moL/L的乙酸/乙酸钠缓冲溶液溶解,配成10 mg/mL的溶液,用GPC分析分子量数据。GPC的色谱条件为:A6000M色谱柱(300 mm×8.0 mm,Viscotek),柱温30 ℃,流动相为0.1 moL/L的乙酸/乙酸钠缓冲溶液,流速0.5 mL/min,进样量20 μL,标定色谱柱分子量的标准品是系列分子量的右旋糖酐。

1.2.3 降解产物的FTIR(傅立叶变换红外光谱)和1H NMR(核磁共振氢谱)分析 称取上述制备的部分降解产物(CS15-4～CS15-20)与干燥的KBr以1∶100的质量比混合,压片后进行FTIR分析。FTIR波数范围为400～4000 cm-1,分辨率为4 cm-1,在透射模式下累积128次扫描。另取上述制备的部分降解产物(CS15-4～CS15-20)各30 mg,加入0.5 mL D2O溶解,进行1H NMR分析。

1.2.4 降解产物的粘度系数测定 称取上述制备的部分降解产物(CS15-4～CS15-20)各5 g,配制成浓度为10%的水溶液,用转子粘度计在室温下测定粘度系数。

1.2.5 微波强化壳聚糖固相酸降解和酶降解复合制备壳寡糖 按照上述优化得到的最优参数制备壳寡糖,即称取30 g壳聚糖,置于微波反应器的反应釜中,然后缓慢加入15 mL 12 mol/L的盐酸,充分搅拌混合后,微波加热,微波功率20 W,微波辐射时间20 min。反应结束后,取出物料加入蒸馏水配置成浓度约为10%的溶液,加入一定量的壳聚糖原料调节溶液的pH至5.0左右。最后溶液中加入300 mg的壳聚糖酶APCSN,42 ℃酶降解24 h,4000 r/min离心5 min,清液部分冷冻干燥,得到壳寡糖。

1.2.6 壳寡糖的MS(质谱)和1H NMR分析 称取壳寡糖冻干样品10 mg,使用超纯水配制成0.2 mg/mL溶液,使用MS直接进样检测。质谱检测条件为:ESI 源,正离子扫描模式,毛细管电压为3 kV,锥孔电压为60 V,离子源温度为150 ℃,脱溶剂气的温度为500 ℃,锥孔气流量为50 L/h,脱溶剂气流量为800 L/h,碰撞能量为30～60 V,离子能量为3 V。另取壳寡糖冻干样品30 mg,加入0.5 mL D2O溶解,进行1H NMR测试。

1.3 数据处理

GPC采用LC-solution软件处理数据,MS采用Thermo TSQ Quantum软件处理数据,Origin 6.0软件绘图。

2 结果与分析

2.1 反应参数对微波强化壳聚糖固相酸降解的影响

2.1.1 微波辐射功率 首先研究微波辐射功率对微波强化壳聚糖固相酸降解的影响,表1给出了不同微波辐射功率降解产物的GPC数据(Mn和Mw分别表示数均分子量和重均分子量)。根据GPC分析可知,微波功率越大,其降解产物的分子量越小,即壳聚糖的降解反应、速率随微波功率的增加而加快,其原因在于体系温度是决定降解反应速率的主要因素之一。微波功率越大,体系升温越快,壳聚糖的降解速率越快，当微波功率为20 W时,壳聚糖的降解速率适中,因此固定微波功率为20 W。

表1 不同微波辐射功率降解产物的GPC数据Table 1 GPC analysis of degraded products by microwave irradiation with different power

2.1.2 盐酸用量 继续研究盐酸用量对微波强化壳聚糖固相酸降解的影响。表2给出了不同盐酸用量制备的降解产物的GPC数据。图2为壳聚糖(CS)和部分降解产物的GPC洗脱曲线,与壳聚糖CS相比,降解产物CS12-10、CS15-10和CS18-10的保留时间(Retention time)均有所加长,说明降解反应进行10 min后,降解产物的平均分子量均已降低,其中降解产物CS15-10和CS18-10的平均分子量降低更为明显。图3为不同盐酸用量制备的降解产物的Mw的变化曲线,说明随着降解反应的进行,降解产物的分子量逐渐下降,盐酸用量为12 mL的壳聚糖降解速率相对较慢,而盐酸用量为15和18 mL的壳聚糖降解速率相对更快。

表2 不同盐酸用量降解产物的GPC数据Table 2 GPC analysis of degraded products by microwave irradiation with dosage of hydrochloric acid

图2 壳聚糖(CS)和降解产物(CS12-10、 CS15-10、CS18-10)的GPC洗脱曲线Fig.2 GPC elution curve of chitosan(CS)and degraded products(CS12-10,CS15-10,CS18-10)

图3 不同盐酸用量降解产物的Mw的变化曲线Fig.3 Change curve of MW of degraded products with dosage of hydrochloric acid

壳聚糖酸降解反应,除了体系温度,[H]+的浓度也是决定降解反应速率的主要因素之一。微波强化壳聚糖固相酸降解过程中,壳聚糖首先与盐酸进行成盐反应生成盐酸盐,消耗一定量的[H]+,剩余的[H]+则作为催化剂参与反应,其浓度越高,壳聚糖降解速率越快。GPC数据分析、图2和图3表明,盐酸用量为12 mL的壳聚糖降解速率相对较慢,其主要原因是大部分[H]+与壳聚糖反应生成盐酸盐,起催化作用的[H]+浓度相对较低。盐酸用量为15和18 mL的壳聚糖降解速率较快,主要原因是起催化作用的[H]+浓度相对较高,经微波辐射15 min以上,其降解产物(CS15-15、CS15-20、CS18-15、CS18-20)的重均分子量均小于50000,已达到低分子量壳聚糖的水平。在微波强化壳聚糖固相酸降解反应能够顺利进行的基础上,从环保方面考虑应降低盐酸的使用量,因此最佳降解工艺的盐酸用量为15 mL,即壳聚糖/盐酸的质量体积比为2∶1。

2.2 微波强化壳聚糖固相酸降解产物的结构分析

壳聚糖(CS)和降解产物(CS15-4～CS15-20)的FTIR光谱见图4。FTIR光谱表明,微波强化壳聚糖固相酸降解反应过程中,壳聚糖在不同的降解时间内其结构没有明显变化。随着降解反应的进行,A1150/A1050(A1150和A1050分别代表样品在FTIR光谱中波数为1150和1050 cm-1对应的吸收度,A1150/A1050即两者的比值)数值不断降低,表明壳聚糖单体间的糖苷键在酸降解过程中不断减少[29]。

降解产物(CS15-4～CS15-20)的脱乙酰度用1H NMR法测定[30],数据见表3。通过分析可知,与壳聚糖原料相比,降解产物的脱乙酰度略有增加,说明微波强化固相酸降解反应中,壳聚糖上的N-乙酰氨基会发生少量的脱乙酰反应。

经FTIR和1H NMR分析,表明微波强化壳聚糖固相酸降解反应中,壳聚糖沿主链随机降解,N-乙酰氨基会发生少量的脱乙酰反应,除此之外未观察到其它结构变化。壳聚糖微波固相酸降解过程中,由于壳聚糖能与盐酸进行成盐反应,因此降解产物主要以盐酸盐的形式存在,具有良好的水溶性。

2.3 微波强化壳聚糖固相酸降解和酶降解复合制备壳寡糖

经过上述的相关研究可知,采用微波强化固相酸降解的方法,壳聚糖可在短时间内快速均匀降解,得到重均分子量低于50000且具有良好水溶性的低分子量壳聚糖。但是,当继续加大盐酸用量或延长反应时间,制备平均分子量更低的壳聚糖(重均分子量低于10000)或壳寡糖时,产品的收率就会明显下降且状态变差,其主要原因在于酸降解过程中糖苷键的断裂是随机发生的,随着降解反应的进行会不断地产生大量的单糖,而单糖在酸性的条件下会发生多种副反应导致产品状态差和收率降低,甚至生成毒性物质[31]。

壳聚糖经微波强化固相酸降解处理后,由于其平均分子量已明显降低,溶解后的粘度也将大幅降低。降解产物(CS15-4(CS15-20)的粘度系数数据见表4。根据表4可知,降解产物CS15-10、CS15-15和CS15-20的溶液浓度为10%时,其粘度系数均低于壳聚糖原料(浓度2.5%)。使用经微波强化固相酸降解处理后的低分子量壳聚糖作为酶降解的底物,底物的浓度可大幅提高,从而提高酶降解制备壳寡糖单位时间内的产能。因此,当降解目标产物是重均分子量低于10000的壳聚糖(例如壳寡糖)时,可先采用微波固相强化酸降解制备低分子量壳聚糖(重均分子量10000～50000),然后得到的低分子量壳聚糖再用酶降解制备壳寡糖。这种复合降解方法即能避免酸降解收率低状态差的问题,又可改善酶降解的制备效率,提高壳寡糖单位时间内的产能。

表4 壳聚糖和降解产物的粘度系数Table 4 Viscosity coefficient of chitosan and degraded products

考虑到整个方法的连续性和便捷性,复合降解最佳工艺为微波强化固相酸降解反应完成后,得到的低分子量壳聚糖直接溶解进行酶降解,即物料不经过醇洗、干燥等处理过程。由于微波固相酸降解中[H]+是过量的,因此溶解后溶液的pH可能会过低,影响酶解的效率,可通过添加适量的壳聚糖原料来调节溶液的pH至酶降解适合的区间(壳聚糖酶APCSN为4.2～6.0),从而使酶降解反应顺利进行。

以降解产物CS15-20(降解产物CS15-10,CS15-15经调节pH处理后,其粘度系数均大于972.5 cm·g·s)的微波强化固相酸降解反应条件,研究微波强化固相酸降解和酶降解复合制备壳寡糖。微波强化壳聚糖固相酸降解反应结束后,取出物料直接加入蒸馏水配置成浓度约为10%的溶液,测定溶液的pH为1.4左右。向溶液中添加壳聚糖原料(约4.5 g),待其完全溶解后溶液,测定溶液的pH为5.0左右(处于壳聚糖酶APCSN降解的适合区间),此时溶液的粘度系数为524 cm·g·s(仍低于2.5%的壳聚糖溶液,说明在粘度上酶降解反应可以顺利进行)。最后添加壳聚糖酶APCSN进行酶降解反应,得到壳寡糖COS。这种复合降解最后酶降解时壳聚糖底物的浓度可达11.5%,是目前酶降解法制备壳寡糖生产工艺中壳聚糖底物浓度(2.0%～2.5%)的4倍以上,即壳寡糖单位时间内的产能可提高4倍以上。

最后用MS和1H NMR对制备的壳寡糖COS的结构进行了分析。

MS检测(图5)及分析结果显示,壳寡糖COS的主要成分为全脱乙酰的壳二糖至壳五糖,此外还含有少量的含乙酰基的壳寡糖组分。图6为壳寡糖COS的1H NMR谱图,为典型的壳寡糖1H NMR谱图,壳寡糖的脱乙酰度为88%。

图5 壳寡糖COS的MS分析 Fig.5 Mass spectrometry analysis of chitooligosaccharides COS

图6 壳寡糖COS的1H-NMRFig.6 1H-NMR of chitooligosaccharides COS

MS和1H NMR的分析表明,壳寡糖COS的主要组成成分与壳聚糖直接酶降解制备的壳寡糖(中国科学院过程工程研究所提供,壳聚糖用稀盐酸溶解后酶降解,浓度为2.5%,酶的种类和反应条件与本文完全相同)的结构基本完全一致,说明微波强化固相酸降解和酶降解复合制备壳寡糖完全具有可行性,可以显著提高壳寡糖单位时间内的产能。

3 结论

本研究建立了一种基于微波强化固相酸降解的高效制备低分子量壳聚糖的方法。利用微波对酸化物料的选择性加热特点,有效解决了常规加热方式壳聚糖固相酸降解过程中物料的快速均匀加热难题。壳聚糖固相酸化物料可在微波作用下短时间内快速均匀降解,高效制备重均分子量在10000～50000的低分子量壳聚糖,且糖单元的结构在反应过程中保持稳定。当降解目标产物重均分子量低于10000时(例如壳寡糖),微波强化固相酸降解仍无法解决传统壳聚糖酸降解收率低、状态差的问题。针对此问题本研究提出采用微波强化壳聚糖固相酸降解和酶降解复合工艺,该工艺操作简便,可有效解决壳聚糖酸降解收率低和酶降解效率低的问题,壳寡糖单位时间内的产能可提高4倍以上。

本研究制备的低分子量壳聚糖和壳寡糖以盐酸盐的形式存在,其在功能和生物活性方面与传统壳聚糖酶降解制备的产品(多为醋酸盐)是否存在差异,还需进一步研究。