郭 芸,刘思渊,隋志伟,王梓权,王 斌,朱 文,林 婧,李海涛

(1.山西药科职业学院,山西太原 030031; 2.中国计量科学研究院前沿计量科学中心,北京 100029; 3.南京市计量监督检测院,江苏南京 210049 4.山西省生物研究院有限公司,山西太原 030006)

食品是人类生存和发展的物质基础,食品安全问题也越来越受到社会广泛的关注。食源性病原微生物是引起食品安全问题的主要因素之一。目前,我国现行的食品微生物检验标准为GB4789系列《食品安全国家标准食品微生物学检验》[1],标准中的检验方法都是以传统微生物学培养为基础的经典检验方法。培养基是方法中所必须采用的生化试剂,其质量直接影响食品微生物检验结果的准确性[2],因此,培养基的质量控制十分重要[3]。

菌落总数是食品微生物检测中最基本、最常见的检测项目[4]。平板计数琼脂(plate count agar,PCA)培养基作为检测菌落总数所用培养基,也广泛用于我国的微生物实验室[5-7]。PCA培养基的质量控制包括外观、溶解性能、pH、水分等物理指标及生长率等微生物指标,其中,生长率是PCA培养基质量控制的关键指标之一[8]。根据杜宗绪[8]研究,质控菌株在不同品牌的PCA培养基上的生长率存在差异。因此,有效的生长率评价方法是确保菌落总数检测结果准确性的有效手段之一。

根据GB4789.28-2013《培养基和试剂的质量要求》及相关标准[9-10],评价PCA培养基生长率需要使用质控菌株。评价前,质控菌株需要复苏和培养;评价时每个平板的接种水平为20～200 CFU;此外质控菌株还需要接种到参比培养基上进行培养。于瑞莉等[8，11-12]参照标准,对不同品牌PCA培养基的生长率进行了评价。然而,现行的评价方法存在四方面的缺陷。第一,质控菌株的复苏和培养需要较长的时间。第二,参比培养基的制备和质量控制需要花费较多的工作量。第三,质控菌株的接种量难以做到精确的控制,实验室内部难以重复,方法的重复性有待提高。第四,实验的地点、方法、人员、器具、材料都有可能对生长率评价结果产生影响[13-14]。而根据《病原微生物实验室生物安全管理条例》[15],微生物样本的运输存在很大的限制。因此,国标方法难以用于不同实验室同时进行培养基评价,方法的再现性有待提高。

标准物质是具有均匀且既定的特性值,用以测量装置校准、测量方法评价或材料赋值的一种材料或物质[16-17]。目前,微生物领域的标准物质在能力验证、仪器校准、方法评价等方面有着广泛的用途[18-19],其在培养基生长率评价方面也有较大的应用前景。

综上所述,本研究选用大肠杆菌作为评价菌株,将其制备成量值均匀稳定的标准物质,建立一种使用标准物质评价PCA培养基生长率的方法,并对方法的实验室内重复性和实验室间再现性进行了验证。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

PCA培养基品牌 北京陆桥、广东环凯、青岛海博、北京奥博星、北京三药、上海齐一、北京沃凯、美国BD、英国Oxoid(对9个品牌随机编号,为A1、A2、A3、A4、A5、A6、A7、A8、A9);大肠杆菌(Escherichiacoli,CICC 10389) 中国工业微生物菌种保藏中心;磷酸盐缓冲溶液(PBS,phosphate buffered solution,pH7.2±0.2)、营养肉汤培养基、胰蛋白胨大豆琼脂培养基 北京陆桥技术有限责任公司;脱脂奶粉 美国BD公司;海藻糖、蔗糖、谷氨酸钠、麦芽糊、抗坏血酸钠 分析纯,Sigma公司。

Genesis SQ eL-85型冻干机 SP Scientific公司;BS224S型电子天平、1-14型离心机 赛多利斯科学仪器(北京)有限公司;HZQ-X100型恒温振荡培养箱 江苏太仓市实验设备厂;DNP-9272型恒温培养箱 上海精宏实验设备有限公司;去离子水 机默克化工技术(上海)有限公司;HG-50型高压灭菌锅 日本Hirayama公司。

1.2 实验方法

1.2.1 大肠杆菌标准物质的制备 根据本实验室先前的制备工艺[18]制备大肠杆菌标准物质。将大肠杆菌接种于营养肉汤培养基,37 ℃、200 r/min培养12 h。随后10000×g离心5 min,弃去上清液,菌泥用PBS重悬并稀释,得到适宜浓度的大肠杆菌菌液。参考先前的配方[18]配制保护剂,加入大肠杆菌菌液后,将保护剂分装至棕色西林瓶中。分装完毕后,将西林瓶转移至冻干机内进行冻干。冻干结束将样品压盖密封,得到大肠杆菌标准物质。标准物质的测定方法参考GB4789.2-2016《菌落总数测定》[5],使用PCA培养基,采用平板计数方法进行菌落总数测定。

1.2.2 大肠杆菌标准物质均匀性和稳定性评估 参考ISO[20],对标准物质的均匀性和稳定性进行评估。均匀性评估中,随机抽取11个单元的标准物质进行检测,每瓶样品重复检测3次;稳定性评估中,分别在0、7、38和99 d,每次从-20 ℃随机选取3个单元的样品进行检测。均匀性评估和稳定性评估所使用的PCA培养基均为A8品牌。为了保证标准物质量值的准确可靠,评估前需要参考GB 4789.28-2013《培养基和试剂的质量要求》[10],对A8品牌PCA培养基进行严格的质量控制,确保大肠杆菌在该培养基上的生长率大于0.9,高于国标中生长率大于0.7的要求。

1.2.3 大肠杆菌标准物质的定值 依据JJF 1343-2012《标准物质定值的通用原则及统计学原理》[21],标准物质经由10家通过CNAS认可的实验室合作定值[22]。10家实验室所使用的PCA培养基包含了A1、A8两个国产品牌,A4、A5两个进口品牌,涵盖了目前市场上常见的培养基品牌。定值前,各家实验室参考GB 4789.28-2013《培养基和试剂的质量要求》[10],对所用PCA培养基进行质量控制,确保大肠杆菌在培养基上的生长率大于0.9。

1.2.4 PCA培养基生长率评价方法 使用待评价的PCA培养基,对一个单元的大肠杆菌标准物质进行3次测定。根据式(1),计算大肠杆菌在该PCA培养基上的生长率。

式(1)

式(1)中,PR为待测PCA培养基的生长率;NS为三次使用待测PCA培养基测定大肠杆菌标准物质结果的平均值;N0为大肠杆菌标准物质的标准值,为(7.0±1.2)×103CFU/g(见2.2 标准物质的标准值与不确定度)。使用待测PCA培养基测定大肠杆菌标准物质的结果NS应在5.8×103～8.2×103CFU/g之间,因此待测PCA培养基的生长率需满足0.83≤PR≤1.17。

式(2)

式(4)

式(5)

1.2.7 不同品牌PCA培养基生长率的评价 A1～A9九个品牌可以涵盖国内几乎所有微生物实验室所用品牌。使用9个品牌的PCA培养基以及GB 4789.28-2013《培养基和试剂的质量要求》中的参比培养基(胰蛋白胨大豆琼脂培养基),分别对3个单元的大肠杆菌标准物质进行测定。根据式(1)进行计算大肠杆菌在PCA培养基的生长率;同时参考国标方法计算其生长率。

1.3 数据处理

利用SPSS 22.0,MS Excel 2013进行数据的统计分析、图表的制作等。

2 结果与分析

2.1 标准物质的均匀性和稳定性

随机抽取11个单元的标准物质进行均匀性评估。结果(表1)表明,F=0.89

表1 大肠杆菌标准物质的均匀性Table 1 Uniformity of reference materials of Escherichia coli

式(6)

图1 标准物质量值与时间的关系Fig.1 The relationship between the value of reference materials and the time

式(7)

2.2 标准物质的定值与不确定度

表2 大肠杆菌标准物质定值结果Table 2 Valuing of the reference materials of Escherichia coli

式(8)

大肠杆菌标准物质的不确定度由3部分组成:第1部分是A类相对标准不确定度urel(A),来源于10家实验室合作定值;第2部分是B类相对标准不确定度urel(B),包括:移液器带来的不确定度、样品稀释因子带来的不确定度;第3部分是标准物质不均匀性引入的相对标准不确定度urel(bb)和不稳定性引入的相对标准不确定度urel(s)。将这几部分相对标准不确定度合成后计算得到标准值的合成不确定度urel(C),及扩展不确定度U(k=2,置信概率95%)。结果(表3)表明,大肠杆菌标准物质的标准值为(7.0±1.2)×103CFU/g。

表3 标准物质不确定度评定Table 3 Uncertainty evaluation of the reference materials

2.3 评价方法的重复性

每天使用大肠杆菌标准物质,对A8品牌PCA培养基的生长率进行3次重复独立的评价,连续评价3 d,进行重复性验证。结果如表4所示,A8品牌PCA培养基的生长率的9个独立结果均满足0.83≤PR≤1.17。评价方法的重复性相对标准偏差为9.09%。

表4 评价方法的重复性Table 4 Repeatability of the evaluation method

2.4 评价方法的再现性

评价方法的再现性经由6家实验室进行验证。每家实验室使用3个单元的大肠杆菌标准物质,对A8品牌PCA培养基的生长率进行评价。结果如表5所示,测定结果均满足0.83≤PR≤1.17。评价方法的再现性相对标准偏差为14.42%。

表5 评价方法的再现性Table 5 Reproducibility of the evaluation method

2.5 不同品牌PCA培养基生长率

使用大肠杆菌标准物质,对A1～A9九个品牌PCA培养基的生长率进行评价。结果如图2所示,使用本研究所建方法进行评价时,待测PCA培养基的生长率均满足0.83≤PR≤1.17的要求;使用国标方法进行评价时,待测PCA培养基的生长率均大于0.7。本研究所建立的评价方法和国标方法有很好的相关性(R2=1)。此外,不同品牌PCA培养基的生长率存在差异。

图2 九种品牌PCA培养基的生长率Fig.2 The productivity ratio of nine brands of PCA

3 讨论

生长率是PCA培养基质量控制的关键指标之一[25]。因此,建立快速高效的生长率评价方法是确保菌落总数结果准确性的有效手段。本研究基于微生物标准物质,建立了一种新的PCA培养基生长率的评价方法。

评价方法所用的大肠杆菌质控菌株以标准物质的形式存在,并且标准物质研制过程中采用了特定的培养基策略。第一,研制的标准物质的用途为评价PCA培养基的生长率,因此选择PCA培养基作为测定培养基,而非GB 4789.38-2016《大肠埃希氏菌计数》规定的结晶紫中性红胆盐琼脂培养基[26]。第二,合作定值使用了多个品牌的PCA培养基。第三,均匀性和稳定性评估使用了单个品牌PCA培养基。第四,所用PCA培养基均经过严格的质量控制(参考GB 4789.28-2013《培养基和试剂的质量要求》的方法进行评价,生长率大于0.9)。基于所用的培养基选择策略,研制的大肠杆菌标准物质不仅均匀稳定、易于运输,其标准值还具有PCA培养基依赖性,这些特点可以满足PCA培养基生长率评价中对质控菌株的要求。

因此,建立的评价方法可以实现质控菌株接种量的精确控制,解决了现行方法无法实现实验室内不同时间验证的缺陷,具有重复性;可以实现多家实验室间的同时评价,具有再现性。此外,相比于现行方法(表6),本研究建立的基于标准物质的评价方法无需使用参比培养基、无需事先培养质控菌株、无需控制接种量,使得工作量显著减少,所需时间仅为1 d,具有方便快捷的优点。微生物实验室可以实现快速高效的PCA培养基质量控制。

表6 评价方法与现行方法的比较Table 6 Repeatability of the evaluation method

评价PCA培养基生长率所用质控菌株通常包括大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌等[10-12]。本研究仅对大肠杆菌在PCA培养基上的生长率进行了讨论,所做工作尚不完善。但本研究对培养基生长率的评价提出了一个新的思路,相信随着微生物标准物质研制水平的不断进步[27-32],本方法所适用的培养基范围将会进一步提升。

4 结论

本研究建立了一种基于大肠杆菌标准物质的PCA培养基生长率的评价方法。评价方法的重复性相对标准偏差为9.09%,再现性相对标准偏差为14.42%,具有方便快捷的优点,有望解决现行生长率评价方法的缺陷。相信随着微生物标准物质研究的不断推进,培养基的质量控制与监测会越来越标准化和精确化,我国微生物领域与公共卫生领域的研究水平也会不断提高。