谢静雯,于 靖,杨锡洪,2,*,解万翠,2,3,4,*

(1.青岛科技大学海洋科学与生物工程学院,山东青岛 266042; 2.山东省生物化学工程重点实验室,山东青岛 266042; 3.青岛智科检验检测有限公司,山东青岛 266002; 4.青岛信和源生物科技有限公司,山东青岛 266002)

虾酱是一种口感鲜香、营养丰富的海产发酵食品,具有刺激食欲的独特香味,是我国东南沿海地区备受欢迎的调味品,而且在日本、韩国以及东南亚等一些国家的居民也经常食用。虾酱发酵过程中,涉及到糖类、蛋白质等大分子降解,而传统发酵存在周期长、品质不稳定和难以连续化生产等弊端,容易产生有害物质,如生物胺、挥发性盐基氮等[1]。其中,组胺是生物胺中对人类健康影响最大的一类,其不仅会降低产品质量,还会导致食品安全问题[2]。如何在保持虾酱传统风味的同时,利用现代食品加工技术进行改造,降低组胺等有害物质生成,提升产品品质及安全,是目前亟待解决的问题。多种添加剂已被证明可抑制组胺产生,并取得良好应用,降组胺效果明显[3]。

蔗糖在食品添加中具有多种功能,对食品的性状、风味和品质有重要影响。Silva等[4]证明在发酵菌种的生长培养基中加入蔗糖,能提高菌种加热、干燥及储藏时的存活率。Liu等[5]研究葡萄酒发酵技术,发现蔗糖的添加提高了酵母的生长速度和酒精的产量,改变了葡萄酒色泽,并在发酵过程中略微降低了可滴定的酸度。Mah等[6]发现,在发酵凤尾鱼中,蔗糖的添加对组胺的产生有明显的抑制作用。然而,有关添加蔗糖对虾酱成分和感官的影响,以及相关发酵工艺的调整和精进,目前没有进一步的深入分析和研究。

本课题组前期对传统虾酱的微生物多样性进行了研究,分离和鉴定了季氏毕赤氏酵母(Pichiagilliermondii)[7]和黑曲霉(Aspergillusniger)[8]两种发酵优势菌,并应用于虾酱的复合发酵,得到了酵母菌、霉菌及乳酸菌1∶3∶5的最佳混合浓度,提升虾酱感官风味,优化制酱工艺[9]。在此基础上,本论文选取了合适范围的添加量,设置了梯度质量的蔗糖进行快速发酵实验,旨在探究其对虾头酱制酱品质及食品安全性的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

凡纳滨对虾(Litopenaeusvannamei)虾头 湛江国联水产开发股份有限公司;季氏毕赤氏酵母(Pichiagilliermondii)、黑曲霉(Aspergillusniger) 本实验室从广东传统虾酱中分离纯化得到[10];植物乳杆菌(Lactobacillusplanticola)为标准菌株 中国工业微生物菌种保管中心;磷酸组胺(BR) 南京奥多福尼生物科技有限公司;MRS(LactobacilliMRS Broth)液体培养基、PDA(Potato Dextrose Agar)液体培养基、YPD(Yeast Extract Peptone Dextrose)液体培养基 杭州百思生物技术有限公司;其他试剂 均为分析纯。

T18高速均质机 德国IKA;SPX-250B-Z型生化培养箱、净化工作台、HPX-9052MBE型恒温培养箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;PHS-3C酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 复合发酵剂活化 分别挑取纯化后的季氏毕赤氏酵母、黑曲霉以及植物乳杆菌(1∶3∶5最佳复合比例)菌株,分别接种于YPD、PDA和MRS液体培养基,摇床上80 r/min培养24 h(28、37和37 ℃),移取1 mL菌悬液至平板培养基并涂布均匀,恒温培养48 h(28、37和37 ℃)[11]。

1.2.2 快速发酵制酱工艺 工艺流程如图1所示。虾头洗净剪须,巴氏杀菌(75 ℃,30 min)后破碎打浆,放入发酵罐(200 g)中,按比例加入活化菌种、18%食盐和不同梯度蔗糖,培养箱保温(40 ℃,14 d),发酵期间每2 d进行搅拌取样,置于-20 ℃冰箱保藏待测[10]。

图1 虾头酱快速发酵工艺流程Fig.1 The shrimp head sauce rapid fermentation process

1.2.3 蔗糖添加预实验 设置1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%的蔗糖梯度,加入到发酵池中,发酵后进行组胺含量和感官的测定。

1.2.4 理化及营养成分分析 发酵过程pH分析:按照Techaratanakrai等[12]的方法修改。将20 g样品充分溶解于纯水,定容至200 mL,静置20 min,均质(3 min、6000 r/min),过滤后采用酸度计测定。

蛋白质、粗脂肪、总糖及水分含量测定:分别按照GB 5009.5-2010、GB/T 14772-2008、GBT 9695.31-2008、GB 5009.3-2010执行。

1.2.5 安全性指标分析 组胺化合物:10%三氯乙酸取20 mL,与5 g虾头酱混合于三角烧瓶中,超声(55 ℃ 20 min、60 W),中间振荡2～3次,充分萃取、过滤,3次冲洗残渣(10 mL蒸馏水),合并滤液后调pH至5.00±0.02(氢氧化钠250 g/L),加水定容至100 mL,以波长450 nm为参比,采用比色快速法[13]测定。

氨基态氮、挥发性盐基氮及菌落总数测定:分别按照GB/T 5009.39-2003、SC/T 3032-2007、GB 47892-2010进行测定。

1.2.6 感官评定 邀请8名经专业训练后的食品专业研究生作为品评员,请品评员对产品进行感官评定。对样品的风味特征进行评分,评分标准见表1列出[10]。评分包括0～9分,总计10个分数,“0”表示没感受到该风味,“9”则表示此风味浓郁,综合得分=滋味均分×0.4+香气均分×0.6[14]。

表1 虾酱感官评定标准Table 1 Standards for sensory evaluation of shrimp paste

1.3 数据处理

每个实验平均进行3次以上(包括3次),结果以平均值为准。数据采用Microsoft Excel 2016、Origin 9.1及SPSS 16.0进行绘图、处理与分析。

2 结果与分析

2.1 蔗糖添加量筛选

为了选取合适的蔗糖添加剂量,进行发酵实验详细研究,更有效地分析蔗糖对虾酱快速发酵的质量影响,以组胺含量和感官评分作为指标,来考量适宜的添加区间。

如图2所示,在发酵产品中,随着蔗糖的增加,组胺含量先下降后趋于平缓,添加量大于6%时下降趋势变缓。同时,低含量的蔗糖使感官评分有略微的提升,但添加量过多则完全破坏虾酱的发酵风味。已有研究表明,糖含量低于8%利于非高糖酵母生长[15],且含糖量较高时,也会使乳酸菌产酸能力增加从而降低感官风味。综合考虑降低组胺、提升风味、菌种高效发酵和经济等各方面指标,选取2%、4%和6%的蔗糖添加量进行快速发酵实验。

图2 蔗糖添加量对组胺含量和感官评分的影响Fig.2 The effect of sucrose addition on histamine content and sensory score

2.2 蔗糖对理化及营养成分的影响

在菌种发酵过程中,pH是发酵时间和发酵产物生化、微生物特性的重要理化指标[16]。pH不但对组胺的产生起关键作用,还会引起发酵微生物的一系列活动及发酵产品的品质[17]。Fan等[18]评估了南极磷虾的发酵条件对虾酱品质的影响,研究表明pH约7～9时发酵过程较为稳定,产品表现出最佳的品质和性能。图3中所示,发酵过程中,在第2 d虾头酱pH迅速降低,约8.4左右,之后缓慢上升逐渐趋于稳定,约8.6左右。

图3 蔗糖对发酵过程中pH的影响Fig.3 The effect of sucrose on pH during fermentation

发酵过程中,pH始终保持在8.3～8.8的范围之内。发酵初始阶段,虾头在乳酸菌作用下产生酸性物质,出现pH降低的结果。期间,也存在糖酵解途径产生丙酮酸,以及ATP酶解释放能量和磷酸根,促使pH迅速下降[19],与此同时伴随着发酵产品新鲜度的降低。而后,发酵体系中的酶和微生物等逐步降解含氮化合物,如蛋白质、肽类和氨基酸等,引起碱性产物如三甲胺等不断积累,从而使pH增加[20]。与空白对照组相比,蔗糖的添加未引起pH较大波动,说明对产品新鲜度的影响并不明显。

发酵结束后,产品中的各类营养素测定结果见表2,发酵过程对最终产品的营养成分和含量有不同程度的影响。结果显示,粗脂肪含量维持在1.27%～1.56%,添加蔗糖对粗脂肪含量没有显著(P<0.05)影响,添加量2%与6%时与对照组相近,添加4%的产品脂肪含量略低。蛋白质含量维持在9.36～9.66 g/100 g,与对照组9.10 g/100 g相比有轻微上升,可能与发酵功能的微生物蛋白质有关,根据李娜等[21]的研究,蔗糖的添加对其蛋白的生物合成功能有所增加。2%蔗糖添加组的产品水分含量与对照组相近,而添加量4%与6%的产品水分则出现了显著(P<0.05)降低,随着发酵的进行,蔗糖水解为易代谢的碳水化合物,菌种生长代谢较旺盛[22],导致水分消耗增加。发酵虾酱的总糖含量最高为0.519%,2%、4%、6%的蔗糖使虾头酱中总糖含量分别为对照组的2.94、3.79和4.67倍。蔗糖能够水解成还原糖,作为发酵微生物的碳源底物被降解,Tabaszewska等[23]分析了乳酸菌发酵白芦笋的各类营养素,发现总糖含量下降,表明发酵过程对碳素营养源的发酵消耗。除此之外,蔗糖的去向还与美拉德反应有关,可与氨基化合物生成风味产物。

表2 蔗糖添加量对虾酱成分的影响Table 2 Effect of sucrose addition on shrimp paste composition

2.3 蔗糖对安全性指标的影响

组胺是发酵水产品品质和安全的风险因素和重要指标。添加蔗糖对发酵期间组胺含量的影响,结果如图4所示,蔗糖添加剂对组胺的产生有抑制效果,随着蔗糖增加抑制效果上升。发酵0～2 d时,对照组中的组胺含量急剧上升,增加为初始的1.05倍,而后趋于稳定。主要因为原生的产组胺微生物存在于虾头中,且发酵剂中的乳酸菌也具有一定产组胺能力,发酵时微生物代谢强,发酵酶被激活,因此迅速产生大量组胺。除此之外,组胺的产生与游离氨基酸中的组氨酸关系密切[24]。虾头本身含有一定量的蛋白质和氨基酸,随着发酵的进行,微生物大量繁殖,同时产生活力旺盛的组氨酸脱羧酶,作用于游离的组氨酸,即生成大量组胺,作用机制如图5所示[25]。

图4 发酵过程中组胺、TVB-N和AA-N含量变化及发酵完成后的菌落总数Fig.4 The changes in histamine,TVB-N and AA-N contents during fermentation and the total number of colonies after fermentation

图5 蔗糖对发酵中组胺的降解机制Fig.5 The sucrose degradation mechanism of histamine in fermentation

发酵0～2 d,组胺含量急速增加,蔗糖组含量明显低于对照组。4 d后,对照组组胺含量缓慢上升趋于稳定,蔗糖组则出现不同程度的下降。8～12 d,蔗糖组组胺含量下降明显且随蔗糖含量增加而逐级降低,组胺含量与蔗糖添加量呈现负相关。发酵14 d时，2%、4%、6%蔗糖组的组胺含量分别为对照组的71.4%、60.0%和47.4%。

发酵初期,体系中的产组胺微生物活跃度高,此时组胺的形成,对最终产品中的组胺含量有决定性影响[26]。由于蔗糖的增加,发酵池中的渗透压升高,不仅抑制微生物活性,也会抑制组氨酸的脱羧反应,切断了组胺的生成路径。除此之外,有些微生物的繁殖代谢可能促进发酵食品中组胺的降解[3]。随着发酵天数的增加,蔗糖对组胺出现了明显的抑制。发酵进行中,部分蔗糖能够与游离的蛋白质、氨基酸等含氮化合物进行美拉德反应[27],游离氨基酸含量下降,促进了组氨酸的消耗,因此减少了组胺的生成。与此同时,美拉德反应的产物也具有良好的功能特性,不仅提升食品的质量和营养,对发酵中的部分微生物有抑制效果,还会使最终的产品得到独特的香气和滋味[28]。

水产品加工中,由于原料自身携带众多微生物,在生产时容易大量繁殖引起食品腐败,不仅破坏产品原有的感官性状和营养价值,甚至产生毒性物质。戴娟等[29]研究了虾酱罐头的品质变化,以菌落总数为指标,可以直观反映微生物代谢作用,菌落总数的变化对虾酱挥发性物质种类和含量有较大影响。而虞姣姣等[30]研究了不同添加糖对发酵乳菌落活菌数的影响,结果表明糖类促进菌种的增殖和活性。加入蔗糖后发酵产品菌落总数无较大差异,2%样品的菌落总数在104～105CFU/g之间,其余均小于104CFU/g(GB 10133-2014中菌落总数的限定),符合标准。与对照组相比,4%和6%的蔗糖菌落总数略低,可能因为蔗糖含量较高会抑制微生物生长。而其中添加2%的蔗糖菌落总数高于对照组,可能因为较低含量的蔗糖可作为微生物营养源,促进了部分微生物的活动。除此之外,在原有工艺添加食盐的基础上,蔗糖的添加进一步引发渗透压升高,对腐败菌也形成了一定的抑制。

挥发性盐基氮(TVB-N)是水产品质量和新鲜度的重要指标,其含量越高,则产品新鲜度则越低。发酵进行时,由于蛋白酶和腐败菌的存在,就会生成这类含氮的碱基化合物,且具有挥发性,因此TVB-N含量的增加与腐败微生物的活性呈正相关[31]。在发酵初期,微生物繁殖呈现对数增长,菌种活力强、代谢快,促进了酶解反应,将原料中的蛋白质变为游离氨基酸,经过脱羧酶或脱氨酶的进一步催化,生成了氨气等物质,使0～4 d时的TVB-N检测含量大幅提高。4 d后,TVB-N含量出现拐点,除了挥发性所导致的散失,其主要原因是微生物活动受到抑制,高盐和高温也同时降低了酶活,遏制了氨基酸的进一步反应,从而使TVB-N含量缓慢减少[32]。加入蔗糖后,对TVB-N的含量有一定程度的降低,但对其变化趋势并无影响,且TVB-N的含量远低于国家标准450 mg/100 g(SB/T 10525-2009)。

氨基态氮(AA-N)是评价发酵食品质量的关键指标,AA-N越高,则产品品质越高,鲜味越好。发酵开始时,酶活力旺盛,微生物繁殖迅猛,蛋白质作为底物被大量降解酶,酶解产物游离氨基酸和小分子肽的增幅明显,因此测定的AA-N含量陡增,添加蔗糖对其并未产生影响。4 d后,微生物和酶的活性受环境抑制,AA-N含量趋于稳定,蔗糖增加可能会增加发酵池的渗透压,从而使AA-N含量略微低于对照组。蔗糖作为微生物的碳素营养源被微生物发酵利用,对快速发酵虾头酱中AA-N的含量及变化趋势并无影响。此外,该工艺制备的虾酱AA-N含量约0.65～0.70 g/100 g,高于同类产品[33]AA-N含量(0.50～0.62 g/100 g),满足SC/T 3602-2016标准(0.6 g/100 g),有较高的营养价值。

2.4 感官评价比较

感官评价是食品评价体系中最直观和最基本的方法,制定科学合理的指标,直接影响到产品安全和质量的界定。优质虾头酱有明显的发酵香气,口感细腻,滋味浓醇。专业评定员对不同产品的感官评价结果如图6所示。

图6 不同添加量蔗糖对虾头酱产品感官评价的影响Fig.6 The effects of different concentrations sucrose addition on sensory evaluation of shrimp paste

林耀盛等[34]以不同添加量的蔗糖,对风干腊肠的风味进行研究分析,结果表明蔗糖的添加量与产品的醇类和醛类风味物质呈正相关,与酯类和酸类呈负相关。从结果来看,发酵产生氨气味的感官评分依次为5.5、4.8和4.4(2%、4%和6%),均低于对照组,且刺激性气味依次递减。根据Meng等[35]的研究,添加蔗糖可增强谷氨酸脱氢酶系的活性,因此推测,在虾酱发酵中,蔗糖的添加可能促进氨的同化,减少刺激性氨气的挥发,有助于提升感官。但与对照组相比,6%蔗糖组的发酵味和虾味评分依次下降了0.7和0.6,表明蔗糖量的增加对发酵香气也出现轻微的掩盖,影响感官评分。除此之外,当蔗糖添加量为4%时,发酵鲜味的评分达到最高5.4,表明适量蔗糖的加入,推进了发酵时伴随的美拉德反应,有助于生成挥发性化合物,也能产生令人愉悦的香味[36]。与莫星优等[14]的实验结果相比,蔗糖添加后,氨气味降低更明显,甜味更易区分,但总体趋势相近。

3 结论

本文通过理化性质和安全性的测定和分析,综合评价了不同添加量的蔗糖对快速发酵虾酱产品品质的影响。添加蔗糖对发酵产生的组胺有抑制作用,在一定的添加范围内,抑制效果与添加量呈正相关。安全性检测表明,蔗糖对产品的TVB-N、AA-N未产生影响,而较高添加量的蔗糖略微降低菌落总数。同时,pH和营养成分也无明显改变,测定结果表明实验组与对照组变化趋势相近。感官评定显示,低添加量蔗糖一定程度上能改善发酵虾头酱的不良风味,增加香气和产品色泽。结果显示,4%～6%的添加蔗糖对产品品质均有不同程度的改善,而超过6%的蔗糖则影响了虾酱风味。

虾酱发酵中适量蔗糖的添加有助于产品品质的提升,为快速发酵工艺的进一步优化奠定了理论基础。但本次实验并未确定蔗糖的最佳添加量,可以综合工艺参数,对4%～6%的蔗糖添加量细化实验和研究指标,进一步分析虾酱综合质量。增加蔗糖是否会影响发酵剂的活性,特别是酵母的活性是否受到蔗糖的阻遏和抑制,在添加食盐的基础上,复合菌种的耐糖量和最适添加量也需进一步实验研究确定。