王鑫，许志明，李晓阳，石育弘，曾昭洋*

(1.甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000；2.甘肃中医药大学附属医院，甘肃 兰州 730020)

0 引言

糖尿病足溃疡(DFU)是糖尿病患者可能面临的最漫长且代价高昂的挑战，同时DFU 往往会发生在5-7%的糖尿病患者人群中[1]。并且这些溃疡中有又有一半以上是因为被感染[2]。在大多数情况下，严重的感染才是导致DFU 患者全肢体截肢的重要原因[3]。同时有研究指出金黄色葡萄球菌是DFU 中感染的主要微生物[4]。糖尿病足(DF)的病理过程非常复杂，涉及皮肤、肌肉、肌腱、骨、神经和血管的损伤。而糖尿病足感染(DFI)是指微生物的入侵及其在宿主组织中的繁殖，在临床中通常引发于体表屏蔽层的不慎开裂破损。本研究拟制备一种符合糖尿病下肢溃疡发病过程的可操作性强的复合因素模型，在高脂高糖饲料投喂下联合链脲佐菌素(STZ)腹腔注射诱导的2 型糖尿病大鼠基础上，采用弹性胶布包裹，足底皮肤切除，创面肌腱下注射金黄色葡萄球菌质控菌株来建立复合因素糖尿病溃疡模型，以期为更加符合临床发病危险因素特点的糖尿病下肢溃疡模型提供新思路。

1 材料

1.1 实验动物

健康SPF 级雄性SD 大鼠30 只(甘肃中医药大学SPF 级实验动物中心提供，动物合格证号：SCXK(甘)2020—0009)，体重(180±20)g。

1.2 药物及试剂设备

STZ 链脲佐菌素(Sigma 公司)；柠檬酸(北京索莱宝科技有限公司)；柠檬酸钠(北京索莱宝科技有限公司)；质控菌株金黄色葡萄球菌-ATCC29213，菌悬液浓度1×108/mL(甘肃中医药大学附属医院检验科提供)；罗氏活力型血糖仪(兰州科宝生物科技有限公司)。

2 方法

2.1 模型建立及分组给药

糖尿病模型的制备首先对SD 大鼠进行高脂高糖饲料投喂1 月，禁食1 日后腹腔注射STZ 35mg/kg，假手术组注射同等计量的柠檬酸钠缓冲液。3 日后测空腹血糖大于11.1mmol/L 或随机血糖大于16.7mmol/L 视为造模成功，并应在实验过程中每周复测血糖，及时剔除回落不符合标准的大鼠。糖尿病大鼠模型制备后1 周复测血糖符合标准后，开始进行糖尿病溃疡造模。将大鼠右后腿用外科弹性胶布包裹4小时后，松开胶布。腹腔注射麻醉大鼠，所用药物为3%戊巴比妥钠(剂量为0.1mL/100g)。麻醉状态稳定后，右后足剃净绒毛，碘伏消毒三遍。用手术刀及组织剪在每只大鼠右足底爪垫后跟上，沿其自然分界剪切出了一个上底为8mm，下底为3mm，高为15mm 的梯形全层伤口。具体过程为去除全层皮肤，粗纱布拭去浅层组织并逐渐至深筋膜，后用组织剪分离深达深筋膜下，并显露出大鼠足底肌腱，使用止血钳内侧面机械损伤肌腱。术中使用棉球止血，待出血停止后，进行感染菌的接种。将金黄色葡萄球菌悬液(浓度1×108/mL)用磷酸盐缓冲液(PBS)10 倍梯度稀释，每个足底创面朝足尖方向注射该浓度菌液0.1mL。

具体分组为，从30 只SD 大鼠中选择10 只作为假手术组，其余大鼠均进行糖尿病造模，建造成功后。随机将糖尿病大鼠分为复合因素组(n=10)和单纯切除组(n=10)。将三组大鼠进行下肢溃疡造模后，术后常规包扎1 日，于第2 日开始松开纱布，使其自然愈合。观察三组下肢溃疡创面愈合情况。

2.2 观察指标

2.2.1 一般情况观察

观察大鼠造模前后大鼠外观、尿量及活动情况。

2.2.2 大鼠体重检测

分别于腹腔注射STZ 前，注射后2、4、6 周分别测量各组大鼠空腹体重。

2.2.3 大鼠血糖监测

分别于腹腔注射STZ 前，注射后3、7、14 天分别监测大鼠空腹血糖(Fasting Blood Glucose，FBG)、餐后2 小时血糖(Postprandial Blood Glucose，PBG)；具体测量方法：将大鼠置于大鼠固定装置后，尾端显露于其外，将试纸插进血糖仪待血糖仪指示后，用75%的酒精消毒大鼠尾尖，采血针垂直刺入，用另只手的大拇指和食指由大鼠尾巴近心端向远心端驱血，无菌棉球拭去第一滴血，再驱血让血液沾染到试纸(试纸上横向黑色条为采血处)即可。

2.2.4 创面愈合率

将三组大鼠进行下肢溃疡造模后，术后常规包扎1 日，于第2 日开始松开纱布，待其自然愈合。观察三组下肢溃疡创面愈合情况。期间观察每只大鼠的活动、进食、饮水及其他异常情况。各组大鼠均于制创后的第3，7，14 对大鼠进行溃疡创面拍照，用Image J 软件测定溃疡创面面积，计算创面愈合率。其中创面愈合率=(原始创面面积-未愈合创面面积)/原始创面面积×100%。

2.2.5 创面愈合时间

以创面愈合面积≥95%糖尿病下肢溃疡面积为完全愈合，分别记录每只小鼠创面愈合时间。

2.2.6 于溃疡形成后第14 天三组各随机取1 只大鼠,切取大鼠足底溃疡面及周围全层皮肤,10%多聚甲醛固定,石蜡包埋,HE 染色,光镜下观察愈合情况。

2.3 统计方法

结果用表示，所有数据做方差齐性检验，符合正态分布的采用单因素方差分析，P＜0.05 为有统计学差异。

3 结果

3.1 大鼠一般状况

大鼠腹腔给予STZ 后，第3 日即出现明显的多饮、多食、多尿及粪便增多现象，其中尤以多饮、多尿最显著。弥漫烂苹果样的特殊气味等典型的糖尿病症状，随着时间延长，上述症状逐渐加重。至第2 周逐渐开始，单纯切除组与复合因素组均出现精神萎靡，行动迟缓，皮毛灰黄无光泽，消瘦，饮水量及小便量已达到正常大鼠的5～6 倍，进食量为正常大鼠的2～3倍。假手术组组大鼠则精神良好，行动敏捷，二便正常，体重逐渐增长。

足底制创后，假手术组大鼠溃疡面肉芽组织爬生良好，渗出物较少；复合因素组糖尿病足底制创后患足红肿、感染、黄色脓性分泌物形成。而单纯切除组下肢溃疡面仅变现为红肿，渗出物稍多。

3.2 大鼠体重变化

腹腔给药STZ 前，三组大鼠之间体重无明显变化。给药后第2 天，单纯切除组、复合因素组大鼠尿量明显增加，假手术组无明显变化。给药后前3 天，三组大鼠体重无明显变化；给药后2w、4w、6w 测量大鼠体重，单纯切除组、复合因素组大鼠体重逐渐减轻，与假手术组比较差异具有统计学意义(P＜0.05)；给药后，单纯切除组、复合因素组大鼠体重均减轻，差异无统计学意义(P＞0.05)。见表1。

表1 各组大鼠不同时间点体重情况()

表1 各组大鼠不同时间点体重情况()

3.3 大鼠血糖的变化

腹腔给药STZ 前，三组大鼠空腹血糖无明显变化；给药后3d、7d、14d 检测FBG、PBG，结果显示单纯切除组、复合因素组空腹血糖较假手术组明显升高，给药后，单纯切除组与复合因素组FBG、PBG 升高水平的差异不具有统计学意义(P＞0.05)；假手术组FBG、PBG 较前无明显变化。给药后2w，单纯切除组与复合因素组整体血糖水平逐渐呈上升趋势。见表2。

表2 给药后各组大鼠不同时间点FBG、PBG 水平()

表2 给药后各组大鼠不同时间点FBG、PBG 水平()

3.4 创面愈合情况及愈合率见表3 及

表3 各组大鼠创面愈合率比较()

表3 各组大鼠创面愈合率比较()

各组大鼠创面随着时间推移不断愈合，其中假手术组愈合效果最好，其次为单纯切除组，而复合因素组愈合率最差。复合因素组与单纯切除组相比，在第3 天、7 天和14 天的创面愈合率显著降低(P＜0.05)；与假手术组之间不具有统计学差异(P＞0.05)。

3.5 创面愈合时间

与其他组相比，复合因素组糖尿病溃疡创面愈合时间明显延长，差异具有统计学意义(P＜0.05)；而单纯切除组创面愈合时间长于假手术组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，结果见表4。

表4 各组大鼠糖尿病溃疡创面愈合率()

表4 各组大鼠糖尿病溃疡创面愈合率()

3.6 糖尿病足溃疡大鼠模型制作结果

病理学观察：溃疡形成后第14 天，病理结果示复合因素组局部覆盖血痂，肉芽组织较多，表皮覆盖不完全，创面炎症反应重，愈合差；单纯切除组肉芽组织不明显，表皮覆盖完整，皮下纤维组织排列规则，见有散在炎性细胞，愈合尚好。而假手术组则较单纯切除组新生血管变得丰富，且管腔较大，大量的红细胞位于管腔中。复合因素组成功建立糖尿病下肢溃疡模型。

4 讨论

糖尿病下肢溃疡作为糖尿病的并发症之一，具有迁延难愈、治疗过程漫长且反复发作等特点，往往使患者及其家庭的现实负担加重并身心俱疲[5]。糖尿病下肢溃疡的发生是由血管病变、神经病变、局部感染及足底生物力学改变等多种危险因素共同作用的病理结果。在研究中，重要的是动物模型要模拟病人伤口愈合延迟的潜在病理生理机制。但目前，对于哪种动物模型最能代表人类糖尿病下肢溃疡尚无共识[6]。在过去的糖尿病下肢溃疡研究中，切除伤口模型被认为更适合研究溃疡伤口愈合，因为它会产生更多的疤痕组织便于进行实验分析[7]。通常在大鼠或小鼠背部造成伤口[8-11]。但这些伤口模型都没有使用2 型糖尿病动物而是1 型糖尿病。由于全世界90%的糖尿病患者患有2 型糖尿病[12]，并在此基础上不慎形成糖尿病下肢溃疡。上述模型的造模方式的优势在于，进行创面面积的量化分析便于临床实际中的疗效评价，尤其是用于外用辅料及药物的研究，可获得能够分辨新生上皮与肉芽界限的图像。Jeremy Rich 等[13]建立的金黄色葡萄球菌感染NOD 小鼠后肢模型，该研究采用金黄色葡萄球菌感染的方法对糖尿病下肢溃疡模型的建立具有重要的借鉴价值。由于骨骼和皮肤之间的软组织很薄，机械压力和剪切力的缓解是糖尿病下肢溃疡管理中的一个关键因素[14]。在模拟糖尿病下肢溃疡生物力学因素时，局部加压对末梢微循环及神经改变很有意义。同时，将溃疡面建立在大鼠足底也更加符合临床实际发病过程，且这种溃疡面常规包扎后由于大鼠活动的进行依然产生慢性机械损伤，这将与糖尿病下肢溃疡迁延难愈的病理表现一致。因此建立一个与临床发病危险因素相符合的动物模型对于糖尿病下肢溃疡的研究是有现实意义的，而且应该是2 型糖尿病基础上的足底复合因素的模型。

课题组通过建立这种符合糖尿病下肢溃疡发病过程的可操作性强的复合因素模型，结果表明投喂高脂高糖饲料联合STZ 给药注射后，糖尿病模型稳定。同假手术组比较，单纯切除组与复合因素组大鼠体重逐渐减轻；单纯切除组、复合因素组FBG、PBG 水平相比较假手术组明显升高。模拟糖尿病下肢溃疡发病的多种危险因素，采用包括了局部加压、全层足底皮肤切除、机械毁伤并接种感染菌液的复合方式后，假手术组大鼠溃疡面肉芽组织爬生良好，渗出物较少；复合因素组糖尿病足底制创后患足红肿、感染、黄色脓性分泌物形成。而单纯切除组下肢溃疡面仅变现为红肿，渗出物稍多。结合大鼠一般情况该模型比较符合临床2 糖尿病患者因足部外屏障破裂迁延难愈发展为糖尿病下肢溃疡的病理过程。

综上所述，建立这种与临床发病危险因素相符合的2 型糖尿病基础上的足底复合因素模型是便于糖尿病下肢溃疡研究的。