宋迁甲，姚娟，燕建锋，方舒，黄城

(1.新疆医科大学研究生学院，新疆 乌鲁木齐 830000；2.新疆维吾尔自治区人民医院心内科，新疆 乌鲁木齐 830000；3.新疆石河子大学，新疆 石河子 832000)

0 引言

心房颤动(atrialfibrillation，AF，以下简称房颤)是近数十年来愈加热门的心律失常疾病，现房颤的发病率不断增高，老年人的房颤发病率可达3%-5%[1]，由于房颤常导致心衰和脑卒中，使住院率、病死率升高，小到家庭，大至社会均带来了巨大的经济和心理负担。异常调控的离子通道蛋白引发的离子流重构和电重构是房颤发生发展的分子基础，随着医疗卫生技术的不断更新进步，与房颤相关的miRNA 的研究引起了愈多的重视。虽有一些房颤射频消融术后患者外周血及心房组织中miRNAs 表达水平的报道[2-3]，但关于冷冻球囊消融术的上述相关研究目前国内罕有报道，本文探讨冷冻球囊消融术对调控钠离子通道蛋白的miRNA 的影响和调控作用，分析与房颤发生发展相关的预警标志物，可能会为房颤的治疗提供不同的思路与方向。报道如下。

1 资料与方法

1.1 研究对象

样本取自于2017 年1 月至2019 年10 月在新疆自治区人民医院心内科住院的阵发性房颤患者45 例，男35 例，女 10 例，年龄(57.8±9.6)。入选标准：(1)依据国内外通用的诊断标准[4]，根据病史、发病时症状、体征、ECG 或动态ECG 资料明确诊断阵发性房颤且接受冷冻消融术随访3 个月无复发者；排除标准：年龄＞75 岁，甲亢，糖尿病，血压控制不良[收缩 压＞140mmHg 和(或) 舒张压＞90mmHg(1mmHg=0.133 kPa)]，左室功能减低(EF＜40%)，严重冠动疾病，肝、肾功能障碍，急、慢性感染疾病，心肌结构性病变。患者入组后均接受血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)、血管紧张素受体抑制剂(ARB)、他汀类等药物规范控制血压、血脂等治疗。停用β阻剂和其他抗心律失常药物，后期随访房颤复发者予以排除。对照组为同病区无房颤的患者15 人，男10 例，女 5 例，年龄(59.0±10.0)。本研究经我院伦理委员会审核批准，所有研究对象均签署知情同意书。

1.2 标本采集

在实验组中，患者在冷冻消融术前空腹下分别抽取4mL外周静脉血，对照组同期抽取相同性质血样4mL，分别置于EDTA 抗凝管中，2 h 之内分离血浆，1500 r/min，离心15 min，吸上清液至冻存管中，-80 ℃保存备用。对于术后转复为窦律，期间无复发的手术患者在术后3 月后我科复诊，按先前同样条件下再次采取静脉血保存。

1.3 主要试剂及仪器

TRhol Reagent 和miRNeasv mini 试剂盒、miRCURYTM Array Power Labeling kit 标记试剂盒、CIP 和CIP buffer 的混合物(1:1)、标记缓冲液、荧光探针(Hy3a、9、DMSO 和标记酶、总RNA 提取试剂盒(上海羽朵)，DEPC 处理水(无锡菩禾)，氯仿/无水乙醇(上海国药)，SYBRGreen PCR 试剂盒(Thermo F-415XL)，逆转录试剂盒(Thermo #K1622)，红细胞裂解液(无锡菩禾)、低温冷冻离心机(Sigma 3K15)，Real-time 检 测仪(ABI-7500)。

1.4 试验方法

(1)提取RNA；(2)RNA 的提取及标记；(3)芯片杂交；(4)实时定量PCR(real—time PCR)；(5)靶基因预测：主要通过mirbase、miranda、targetscan 三大数据库来进行miRNA 靶基因预测。利用Kyoto Encyclopediaof Genes and Genomes(KEGG)数据库对预测结果进行信号通路归类，然后根据GeneOntology project数据库对靶基因参与的生化过程、细胞组分及分子功能进行分析。筛选所得靶基因至少存在于2 个数据库中；(6)对预测的靶基因进行qRT-PCR 验证。5 个选择qRT-PCR 的基因引物序列如表1：

表1

1.5 统计学处理

数据输入EXCEL 表格，并使用SPSS 23.0 软件包完成。使用VolcnoPIot 法获得差异表达，以病例组与对照组外周血比值＞1.5 倍认为是显著上调，比值＜1.5 倍认为显著下调，均用t检验。P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 基线资料比较

在冠心病、糖尿病、高血压、心力衰竭、卒中患病率对比中，实验组明显高于对照组，左房内径(LAD)差异有统计学意义(P＜0.05)。在性别、年纪、吸烟、饮酒、体重质量指数(BMI)、左室舒张末期内径(LVEDD)、左室射血分数(LVEF)、BNP 方面差异无统计学意义(均P＞0.05)。详见表2A、2B。

表2A

2.2 miRNA 表达谱

通过将结果与已知基因组进行比较并通过mirdeep2 软件进行统计，可以获得miRNA 表达定量，miRNA 表达阈值是将每组中的(Counts per million reads)CPM 平均值超过≥1 的miRNA 视为在该组中表达并进行统计分析。首先，设定阈值为1.5 倍差异，p-value ≤0.05 且组内CPM 均值≧1 来筛选差异表达miRNA，我们分析了整个AF 组(n=45)和SR(n=15)组之间miRNA 的表达。(图A)散点图、(图B)火山图、(图C)聚类热图显示了手术后与手术前对比miRNA 显著差异表达的变化。

表2B

图A

2.3 miRNA 靶基因预测结果

基于靶基因数据库，分别对差异显著上、下调的miRNA进行靶基因筛选，结果发现SCN5A 相关联的miRNA hsalet-7i-5p 与房颤明显相关，术前与术后相比明显上调，此外，DAAM2 基因相关联的miRNA hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相关联的miRNA hsa-miR-1255a 也显著上调，发现代表KCNA5(钾离子通道相关基因) 的miRNA hsa-miR-4433b-3p 与房颤明显相关，术前与术后相比明显下调。

2.4 差异表达miRNA 的qRT-PCR 验证结果

验证选择了代表调控钠离子通道蛋白miRNA 的SCN5A基因进行了qRT-PCR 验证，其中用内对照基因(管家基因 GAPDH)进行校正，进行相对表达量分析。qRT-PCR 结果显示，与术前相比，术后SCN5A 的表达水平显著上升，与测序结果相吻合。(*P＜0.05，**P＜0.01，与术前相比较)。如图2A、2B。

3 讨论

AF 的主要病理生理过程是心房重构，包括电重构、结构重构和细胞内Ca2+稳态异常[5]，近年来的研究认为，异常调控的离子通道蛋白引发的离子流重构和电重构是房颤发生发展的分子基础，miRNA 参与心房电重构和结构重构。在AF的动物模型、房颤患者的心脏组织和血液中都有miRNA 的异常表达，且miRNA 表达调控能增强或减弱AF 的易感性[6]。SCN5A 基因位于3q21 人类染色体并编码心脏钠通道 Nav1.5蛋白，主要存在心肌细胞中，该通道蛋白负责钠离子内向电流的峰值，影响心房、心室细胞和特殊传导组织(浦肯野细胞等)的兴奋性和传导、再极化、晚期钠离子通道[7]。国外有科研表明，AF 发作时，AF 患者右心耳的SCN5A／Nav 1.5 表达降低和峰值钠电流密度降低[8]。Zhao、Huang 等研究者发现在房颤患者心房组织中miR-192-5p 上调，SCN5A 基因表达下调[9]。Daimi 等人发现，miR-219 能正向调控SCN5A 的基因和蛋白表达[10]。有研究分析，对比房颤组、对照组以及房颤复发组研究对象的外周血miRNAs 表达水平发现，有25 种miRNAs 在消融复律术后表达减少或増多[11]。此外，miRNA能抑制不完全互补的靶基因，一种miRNA 可以调节多个靶基因，多种miRNA 又可共同调节同一个靶基因[12]。结合本研究，在预测差异表达的miRNA 靶基因时，基于靶基因数据库，分别对显著差异上、下调的Top 10 miRNA 进行靶基因筛选，hsa-let-7i-5p miRNA 提示显著上调，推测其可能与SCN5A基因、SLC1A4 基因、IGF1R 基因相关联，随后采用qRTPCR技术验证SCN5A 在术后较术前明显上调，符合上述说法。

图B

图C

图2A

图2B

随着年龄的增长，房颤的发生率逐年上涨，即房颤的发生与年龄的增长呈正相关[13]，针对房颤的治疗，药物治疗为先推荐的手段，然而在治疗过程中，有些患者药物治疗效果差或不能耐受药物相关作用，故消融技术应运而生并不断发扬光大，导管消融术成为上述人群的优选治疗方案。目前常用治疗房颤的消融手段为射频消融术(RFCA)和冷冻球囊消融术(CBA)，而CBA 作为一项新技术，较RFCA 学习快捷，操作简单且术后相关并发症少，目前越来越多的的城市将其纳入医保范围，发展前景光明。在本研究中，通过对比发现，hsalet-7i-5p 在术后显著上调，采用qRT-PCR 技术验证靶基因，结果与预测相符，可能机制为hsa-let-7i-5p 的调控使术前房颤的易感性增加，在术后使离子流和电活动发生了逆转。此外，DAAM2 基因相关联的hsa-miR-18b-5p、CLEC4G 基因相关联的hsa-miR-1255a 在本次研究中均显著上调，但上述基因目前与钠离子通道是否有明确联系，目前国内外罕见相关文献报道，需进一步证实。

综上所述，本研究发现，miRNA hsa-let-7i-5p 在房颤患者接受CBA 前后的表达及其含量变化可体现其与房颤有着千丝万缕的联系，hsa-let-7i-5p miRNA 可能通过对SCN5A基因的调控，参与AF 的电重构，由于SCN5A 是心脏动作电位产生的关键，是抗心律失常治疗的靶点[14]，因而miRNA hsalet-7i-5p 可能对于未来房颤的治疗具有意义。但本实验局限是只对比了阵发性房颤手术病人样本，在不同房颤类型中miRNA hsa-let-7i-5p 表达和含量变化是否相同，尚不明确。此外，本研究没有进一步行功能学实验，若想进一步了解及证实miRNA hsa-let-7i-5p 对SCN5A 编码钠通道的功能学作用，仍需更深层次的探索，如电生理及动物实验，对房颤发病机制的调控，治疗的分子靶点的研究有重大意义。