刘艳群，李保胜，李雨阳，刘玉洁，王昊阳，张震阳，孟维艳

种植义齿已逐渐成为牙列缺损或牙列缺失首选的修复方式[1]，但与天然牙相比，种植体周围的上皮封闭效果欠佳，导致细菌更容易突破上皮屏障，引起深层结缔组织甚至骨组织的炎症，引发种植体周围炎。在种植体周围炎的发病过程中，驻留在牙周组织中的巨噬细胞受到病原菌等致病因素的刺激可发生明显的表型和功能变化[2]。目前，牙龈卟啉单胞菌(Poryromonasgingivlis，P.g)被公认为是引起种植体周围炎的主要病原体之一[3]。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)是P.g细胞外壁的主要成分，主要由脂质和多糖构成，是P.g的主要毒力因子。巨噬细胞在P.g-LPS刺激下，向促炎巨噬细胞表型(M1型)转化，通过细胞膜表面Toll样受体4(TLR4)识别LPS，激活核因子κB(nuclear factor-kappa B，NF-κB)信号通路传导信号，分泌炎性介质如肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、白介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)和白介素-6(interleukin-6，IL-6)等募集更多炎症细胞聚集，并促进破骨细胞分化，引起种植体周围软硬组织的破坏[4]。因此巨噬细胞在种植体周围炎的病理发生过程中充当重要角色，通过减少巨噬细胞向促炎表型极化，抑制炎症反应有望成为治疗种植体周围炎的重要靶点。

ω-3多不饱和脂肪酸是从深海鱼类、海藻中提取出来的天然物质，研究表明其具有抗炎、抗菌、抗肿瘤的作用[5]，被应用于肠炎等菌群失调疾病，此外还能够改善糖尿病患者的代谢水平[6]。二十二碳六烯酸(Docosahexaenoic Acid，DHA)是一种人体内无法通过自身合成的ω-3多不饱和脂肪酸，研究表明DHA可以缩短糖尿病患者的伤口愈合时间，减少伤口处促炎型(M1型)巨噬细胞的浸润[7]。此外DHA可以通过减少LPS诱导的巨噬细胞TNF-α的产生进而抑制破骨细胞的生成,发挥骨保护作用[8]。然而，DHA能否影响P.g-LPS引起的巨噬细胞炎症反应以及其对种植体周围炎的作用罕见报道。因此，我们以巨噬细胞模型RAW264.7为研究对象，探究DHA对P.g-LPS诱发巨噬细胞炎症的调控作用，为DHA治疗种植体周围炎提供前期研究基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器与材料

DHA(纯度≥98%，编号1704081)(阿拉丁，中国)；小鼠巨噬细胞系RAW264.7细胞(上海中科院细胞所，中国)；HDMEM培养基、PBS、青/链霉素、0.25%胰酶(Hyclone，美国)；P.g-LPS(InvivoGen，美国)；CCK-8试剂盒(碧云天，中国)；ELISA试剂盒(R&D，美国)；细胞RNA提取试剂盒(博麦德，中国)；PrimescriptTMTaKaRa逆转录试剂盒、SYBR PrimerScriptTMRT-PCR Kit(Takara，日本)；qRT-PCR扩增仪MX3005P(Agilent，美国)；荧光倒置显微镜(Olympus，日本)；CO2恒温细胞培养箱(SANYO，日本)；二甲基亚砜DMSO(北京化工厂，中国)；活性氧检测试剂盒(万类生物，中国)。

1.2 DHA的配制

DHA溶解在DMSO中制成100 mmol/L的原液，用培养基稀释至最终浓度100 μmol/L，确保最终用于后续免疫活性测定实验的溶液DMSO的含量小于0.1%。

1.3 细胞培养

取-80 ℃冻存的RAW264.7细胞，立即置于37 ℃快速溶解，之后将含有RAW264.7细胞的冻存液转移到10 mL HDMEM中，1 500 r/min、3 min离心后弃上清，用2 mL含有10%胎牛血清的HDMEM重悬细胞，接种在2个25 mm2培养瓶中，置于37 ℃、5%CO2培养箱中，每2 d换液1次，取对数期细胞用于后续实验。

1.4 细胞毒性实验

将3×103个RAW264.7细胞接种于96孔板中，待细胞贴壁后设置对照组(HDMEM培养基)、P.g-LPS组(1 mg/L)、P.g-LPS+DHA组(25、50、75、100 μmol/L)，每组设3个复孔。对照组细胞正常培养24 h，然后换液继续用HEDME培养基培养24 h；P.g-LPS组用1 mg/LP.g-LPS预处理24 h，然后用HDEME培养基培养24 h；实验组分别用终浓度为1 mg/LP.g-LPS预处理24 h，然后分别加入含25、50、75、100 μmol/L 的DHA培养基培养24 h后弃去培养基，每孔加入100 μL HDMEM和10 μL CCK-8试剂孵育2 h，450 nm波长处测定吸光度(D)。

1.5 实验分组

在六孔板中以2×105个/孔的细胞密度接种RAW264.7，根据上述细胞毒性实验结果设为5组：对照组(HDMEM培养基)，P.g-LPS组(1 mg/L的LPS可以活化巨噬细胞[9-10])，以及P.g-LPS+DHA组(25、50、75 μmol/L)3个实验组，每组3个复孔，实验重复3次。

1.6 实时荧光逆转录定量PCR(qRT-PCR)检测

用RNA快速提取试剂盒提取RNA，于Nano Drop2000分光光度计上检测RNA浓度，按照PrimescriptTMTaKaRa逆转录试剂盒说明书操作合成cDNA，按照SYBR PrimerScriptTMRT-PCR Kit说明书联合荧光定量PCR仪进行扩增和检测，反应条件为95 ℃预变性1 min，95 ℃变性5 s，60 ℃退火20 s，共40个循环。反应总体系为20 μL，cDNA模板2 μL，无酶水4 μL，上下游引物各0.5 μL，2×SYBR Green Master RT-PCR ROXmix1 3 μL。引物见表1，每次扩增以 β-Actin基因为内参，采用相对定量法2-ΔΔct对PCR产物进行分析，比较各组TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达。

表1 引物序列及扩增长度

1.7 酶联免疫吸附实验(ELISA)检测

提取各组细胞上清液，在超速离心机中以2×105r/min离心20 min，按ELISA试剂盒操作步骤分别检测炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的分泌量，在酶标仪波长为450 nm和570 nm的情况下检测其吸光度，做出标准曲线，计算TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白的生成浓度。

1.8 DCFH-DA检测活性氧(reactive oxygen species，ROS)的产生

在六孔板中以2×105个/孔的细胞密度接种RAW264.7，待细胞贴壁后生长至密度为70%时进行加药处理。对照组细胞正常培养24 h，然后换液继续用HEDME培养基培养24 h；P.g-LPS组用1 mg/LP.g-LPS预处理24 h，然后用HDEME培养基培养24 h；实验组分别用终浓度为1 mg/LP.g-LPS预处理24 h，然后分别加入含25、50、75 μmol/L 的DHA培养基培养24 h将各组细胞上清液弃去，加入PBS清洗2次。分别加入1 mL的DCFH-DA稀释液(按照1∶1 000用无血清培养基稀释)混匀，置于37 ℃培养箱内孵育20 min，每隔3 min颠倒混匀。用PBS洗细胞3次，充分去除未进入细胞内的DCFH-DA，荧光显微镜下观察细胞。然后用Image J软件进行图像分析，获得荧光强度总和。

1.9 统计学分析

2 结 果

2.1 DHA对P.g-LPS诱导的RAW264.7细胞的毒性作用

①与对照组相比，1 mg/L的P.g-LPS可引起巨噬细胞的增殖，细胞活性增强，但差异不具有统计学意义(P>0.05)。②100 μmol/L的DHA明显抑制P.g-LPS诱导的RAW264.7细胞的增殖活性(P<0.05)。③≤75 μmol/L的DHA不影响P.g-LPS诱导过的RAW264.7的增殖活性(P>0.05)(图1)。

A：对照组(HDMEM培养基)；B：P.g-LPS组(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/LDHA组；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA组；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA组；F：P.g-LPS+100 μmol/L DHA组；与P.g-LPS组相比，****：P<0.000 1

2.2 25、50、75 μmol/L DHA对P.g-LPS刺激下RAW264.7细胞内炎性因子mRNA表达的影响

5组炎性因子mRNA表达结果如下：①1 mg/L的P.g- LPS刺激RAW264.7细胞，TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达均显著增高(P<0.05)，证明P.g-LPS诱导体外炎症模型成功；②75 μmol/L DHA明显抑制TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达(P<0.05)；③25、50 μmol/L DHA均显著抑制TNF-α、IL-6 mRNA的表达(P<0.05)，但25、50 μmol/L DHA对IL-1β mRNA的表达均无显著影响(图2)。

A：对照组(HDMEM培养基)；B：P.g-LPS组(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA组；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA组；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA组；与P.g-LPS组相比，**：P<0.01，***：P<0.001， ****：P<0.000 1

2.3 25、50、75 μmol/L DHA对P.g-LPS刺激下RAW264.7炎性因子相关蛋白分泌的影响

5组RAW264.7炎性因子相关蛋白分泌结果如下：①1 mg/L的P.g-LPS刺激RAW264.7细胞后，细胞上清液中TNF-α、IL-6的表达均显著增高(P<0.05)；②25、50、75 μmol/L DHA均明显抑制TNF-α、IL-6的分泌(P<0.05)；③各组均未测得IL-1β的分泌(图3)。

A：对照组(HDMEM培养基)；B：P.g-LPS组(1mg/L)；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA组；D：P.g-LPS+50 μmol/L DHA组；E：P.g-LPS+75 μmol/L DHA组；与P.g-LPS组相比，****：P<0.0001

2.4 25、50、75 μmol/L DHA对P.g-LPS诱导RAW264.7细胞ROS的影响

ROS检测结果如下：在免疫荧光显微镜下，5组均出现绿色荧光，且各组荧光强度有明显差异。①对照组仅有少量绿色荧光(图4A)；②1 mg/LP.g-LPS刺激后RAW256.7细胞内绿色荧光强度明显增加(图4B)；③25、50、75 μmol/L DHA组绿色荧光强度减弱，且浓度越高减弱程度越强(图4C、D、E)。④用ImageJ分析各组荧光强度，结果显示P.g-LPS组荧光强度明显增强(P<0.05)，不同DHA组较P.g-LPS组荧光强度明显减弱，有统计学意义(P<0.05)，并且减弱程度与DHA浓度呈正相关(P<0.05)(图4F)。

A：对照组；B：P.g-LPS组；C：P.g-LPS+25 μmol/L DHA；D：P.g-LPS +50 μmol/L DHA；E:P.g-LPS +75 μmol/L DHA；F；探针荧光强度与P.g-LPS组相比，****：P<0.0001； DHA组间对比，#：P<0.01

3 讨 论

种植体周围组织的健康与巨噬细胞密切相关，巨噬细胞可以分泌炎症因子改变种植体周围的局部微环境，一方面清除外来病原体和细胞碎片，另一方面促进局部炎症细胞浸润，损伤种植体周围的软硬组织[4]。因此本实验用种植体主要致病菌P.g的胞外LPS诱导巨噬细胞炎症模拟种植体周围的炎症环境，探究DHA的炎症抑制作用，以期待从限制种植体周围巨噬细胞炎症反应的新视角为种植体周围炎的防治提供新的方案。

目前DHA是公认存在于脑细胞膜的一种抗炎活性分子，其主要通过直接或间接作用于小胶质细胞减少促炎因子的产生而发挥抗炎作用[11-12]。DHA这种抗炎潜力为其在炎症性疾病的治疗应用中开拓了广泛前景。Meital等[13]发现DHA可以减少LPS诱导的腹主动脉瘤患者提取的巨噬细胞促炎细胞因子TNF-α和IL-6的表达以及ROS的产生。此外通过系统性补充ω-3多不饱和脂肪酸(富含DHA)可以减轻牙周炎患者探诊深度，对牙周伤口的愈合具有积极作用[14]。因此探究DHA对P.g-LPS诱导的巨噬细胞炎症的抑制作用对后期DHA在牙周炎以及种植体周围炎的应用具有重要意义。

DHA对细胞的毒性作用具有选择性，研究表明100 μmol/L的DHA促进骨髓瘤患者外周血提取的单核细胞凋亡，但对从健康人获取的单核细胞没有不良反应[15]。本研究通过细胞活力检测发现≤75 μmol/L的DHA作用浓度不影响P.g-LPS诱导的RAW264.7细胞的增殖活性，差异不具有统计学意义(P>0.05)。100 μmol/L的DHA明显抑制P.g-LPS诱导的巨噬细胞的增殖(P<0.05)， 该浓度下的DHA作用浓度可能由于其抑制了P.g-LPS诱导过的巨噬细胞的增殖而发挥抗炎作用。为了排除DHA的细胞毒性作用对促炎细胞因子分泌的影响，因此我们呈浓度梯度选择25、50、75 μmol/L的DHA安全作用浓度用于后续实验。

种植体周围炎发生时其周围组织中巨噬细胞的比例明显增高，巨噬细胞是急性期免疫反应的应答者，释放促炎因子TNF-α、IL-1β和IL-6[4]，这些炎性细胞因子又可以作为前体物质诱发后续的炎症级联反应[16]，通过信号传导减少成骨细胞而增加破骨细胞的分化趋向，进而导致种植体周围的骨质流失[17]。研究发现种植周围炎部位的牙龈组织和龈沟液中促炎细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6表达较健康部位增高[18]，这与我们构建的体外炎症模型一致。在P.g-LPS对巨噬细胞无明显的毒性和无促增殖作用条件下，用1 mg/L的P.g- LPS刺激巨噬细胞后，炎性细胞因子TNF-α、IL-1β和IL-6 mRNA表达均明显增高，细胞上清液中TNF-α、IL-6蛋白分泌明显增加，说明P.g-LPS活化巨噬细胞成功，与先前的LPS诱导巨噬细胞炎症反应一致[9-10]。而25～75 μmol/L DHA可显著抑制上述炎症因子的表达，说明DHA可以通过在mRNA水平上抑制TNF-α、IL-1β和IL-6的表达以及在蛋白水平上抑制TNF-α和IL-6分泌，从而减轻巨噬细胞的过度炎症反应引起的组织损伤。但是在各组细胞上清液中均未检测到IL-1β的分泌，我们分析其中原因可能与以下几个方面有关：①巨噬细胞分泌IL-1β需要LPS的启动，小鼠比人的巨噬细胞中LPS的刺激作用更明显[19]，所以可以检测到IL-1β mRNA的表达，但IL-1β的分泌需要更多的信号(ATP、牙龈蛋白酶)参与[20]，因此在仅存在P.g-LPS的条件下，IL-1β不能正常分泌。②IL-1β缺乏自发分泌的信号序列而需要通过一系列的信号通路完成，P.g-LPS诱导巨噬细胞表达前体IL-1β mRNA，前体IL-1β必须要经过NLRP3炎性小体的修饰才能加工为成熟的IL-1β，进而释放至胞外[21-22]，而RAW264.7细胞缺乏组装NLRP3炎性小体的适配器ASC[23]，ASC的缺乏导致前体IL-1β无法转化为成熟的IL-1β，从而无法分泌到细胞上清液中。Wierenga等[24]在LPS刺激RAW264.7细胞后也未检测到IL-1β的分泌，与本实验结果一致。

细菌及其毒力因子透过上皮屏障后与巨噬细胞的TLR4结合，可以诱发细胞内ROS的产生，ROS作为细胞内的第二信使，与炎症级联反应存在偶联，加剧炎症反应，当ROS大量聚积时，可引起细胞DNA片段化、细胞坏死裂解，增加炎性细胞因子的分泌和炎症的放大，从而加重细胞和组织损伤[25-26]。因此细胞内ROS的产生可以间接反映炎症反应程度，本研究发现DHA呈浓度依赖性抑制巨噬细胞内ROS的产生，分析其可能与DHA含有多个双键，能有效还原活性氧的氧化态有关。因此，DHA抑制TNF-α、IL-1β、IL-6表达的机制可能也与其抑制细胞内ROS的产生有关，但具体机制仍需进一步探究。

综上所述，高浓度的DHA可以抑制P.g-LPS活化的巨噬细胞的增殖，安全范围内的DHA可以减少P.g-LPS诱导巨噬细胞内ROS的产生，减少炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表达和TNF-α、IL-6的分泌，发挥抗炎抗氧化作用，为后期探索DHA在种植体周围炎防治方面的应用提供理论依据。