刘延岭，邓 林，陶瑞霄

（四川工商职业技术学院，四川 都江堰 611830）

青稞是禾本科大麦属的一种禾谷类作物，主要分布在我国西藏、青海、四川、云南等地，是藏族人民的主要粮食。青稞营养价值较高，特别是β-葡聚糖含量是普通小麦平均含量的50倍[1-3]。β-葡聚糖具有很高的营养保健功能，既可通过减少肠道黏膜与致癌物质的接触，从而间接抑制致癌微生物作用的方式来预防结肠癌，又可通过降血脂和降胆固醇物质合成的方式预防心血管疾病[4-7]。

酵素是指以一种或多种新鲜蔬菜、水果、菌菇、谷物、中草药等为原料[8]，经多种有益菌发酵而得，含有丰富的维生素、酶、矿物质和次生代谢产物等营养成分的功能性微生物发酵产品[9-12]。酵素产品市场前景较好，而目前以青稞为原料的酵素产品相对较少，因此，开发以青稞为原料发酵而成、具有保健功能的酵素产品具有一定的市场价值。

本研究采用高温蒸料法处理青稞原料，通过青稞（原料）发酵，提高了熟化过程中β-葡聚糖含量。此外采用先乳酸菌发酵后红曲霉发酵的方式，提高了红曲霉次级代谢产物莫纳可林的含量。两种处理不仅为混合发酵提供了新的方法，同时强化了青稞酵素降血脂的保健功能，相较于现有降血脂的保健品，其适用范围更广，功能性更强。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

青稞：市售；乳酸菌（Lactobacillus）、红曲霉菌（Monascus purpureus Went）：由中国科学院成都生物研究所保存。

1.1.2 仪器与设备

ZT1-02型电热蒸煮锅，兴平市中通试验装备有限公司；SYQ-DSX-280B型手提式灭菌器，上海申安医疗器械厂；DS-1型高速组织捣碎机，上海标本模型厂；SXX-103型净化工作台，中国蚌埠净化设备厂；PYX-DH型隔水式电热恒温培养箱，上海市跃进医疗器械一厂；LRH-250型生化培养箱，广州深华生物技术有限公司；XS-212-202型双目电子显微镜，苏州胜视电子设备有限公司；DHR95型可视手持折光仪，德国S+H（中国）有限公司；PHS-3D型pH计，郑州南北仪器设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 辅助降血脂青稞酵素含片的制备

1.2.1.1 工艺流程

青稞→浸泡→磨浆→蒸料→冷却→发酵→喷雾干燥→压片

1.2.1.2 操作要点

筛选：选择麦粒饱满、硬度适中的青稞原料，筛选除杂后用循环水冲洗。

浸泡：将洗净的青稞用2倍质量的无菌水浸泡5 h，至青稞吸水膨胀率为60%，捞出备用。

磨浆：将浸泡后的青稞与同质量的无菌水过胶体磨，磨浆后过90目筛得到青稞浆料。

蒸料：将青稞浆料于一定温度下高压蒸煮30 min。

冷却：将蒸料后的青稞浆料冷却至20℃，得青稞料液。

发酵：在冷却后的青稞料液中加入其质量5.0%乳酸菌种子液（种子液含菌数1×106CFU/mL），静置厌氧发酵6 d至发酵液pH为4.0，得到前发酵液。采用液体振荡发酵法向前发酵液中加入一定量的红曲霉菌种子液（种子液含菌数1×106CFU/mL），在一定的温度振荡频率下继续发酵，发酵8 d至发酵液黏度为4 500～5 000 cP，发酵结束。

喷雾干燥：将发酵液置于喷雾干燥设备中进行喷雾干燥。

压片：将干燥后的青稞酵素在压片机中按0.5 g每片进行压片。

1.2.2 单因素试验设计

1.2.2.1 青稞蒸煮温度对红曲霉发酵的影响

分别取于100、110、120、130、140℃下蒸煮得到的料浆，经乳酸菌发酵后，取100 mL发酵醪，接入其质量5.0%的红曲霉菌（种子液含菌数1×106CFU/mL），在振荡频率100 r/min的恒温震荡培养箱中于30℃发酵8 d，测定成品中β-葡聚糖和莫纳可林的含量。

1.2.2.2 发酵温度对红曲霉发酵的影响

取蒸料温度于120℃下得到的料浆，经乳酸菌发酵后，取100 mL发酵醪，接入其质量5.0%的红曲霉菌（种子液含菌数1×106CFU/mL），在振荡频率100 r/min的恒温震荡培养箱中，分别于20、25、30、35、40℃发酵8 d，测定成品中β-葡聚糖和莫纳可林的含量。

1.2.2.3 振荡频率对红曲霉发酵的影响

取蒸料温度于120℃下得到的料浆，经乳酸菌发酵后，取100 mL发酵醪，接入其质量5.0%的红曲霉菌（种子液含菌数1×106CFU/mL），在振荡频率50、100、150、200、250 r/min的恒温震荡培养箱中于30℃分别发酵8 d，测定成品中β-葡聚糖和莫纳可林的含量。

1.2.2.4 接种量对红曲霉发酵的影响

取蒸料温度于120℃下得到的料浆，经乳酸菌发酵后，取100 mL发酵醪，分别接入其质量4.0%、5.0%、6.0%、7.0%、8.0%的红曲霉菌（种子液含菌数1×106CFU/mL），在振荡频率100 r/min的恒温震荡培养箱中于30℃发酵8 d，测定成品中β-葡聚糖和莫纳可林的含量。

1.2.3 正交试验设计

在单因素试验结果的基础上，选取蒸煮温度、发酵温度、摇床转速和接种量为主要考察因素进行L9(34)正交试验设计，以发酵醪中的莫纳可林含量作为主要评价指标，β-葡聚糖含量作为次要评价指标，其权重系数分别为60%和40%。根据综合评分对其进行正交试验设计分析，其中综合评分=莫纳可林含量/莫纳可林含量最大值×100×60%+β-葡聚糖含量/β-葡聚糖含量最大值×100×40%。试验因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

1.2.4 不同β-葡聚糖和莫纳可林含量制品的降血脂效果评价

1.2.4.1 评价方法

采用脂代谢紊乱模型——预防性给受试物法，按最优发酵条件所制得的样品（X）和直接混合同等剂量β-葡聚糖和莫纳可林所制得的样品（Y）进行对比。

基础饲料为市售普通饲料。高脂饲料由78.8%基础饲料、1%胆固醇、10%蛋黄粉、10%猪油和0.2%胆盐混合而成。受试饲料1由80%高脂饲料、20%样品X混合而成。受试饲料2由80%高脂饲料、20%样品Y混合而成。小鼠平均质量130～140 g。

1.2.4.2 主要实施步骤

用基础饲料喂养大鼠7 d后，空腹过夜取尾血，测血清总胆固醇（TC）、血清甘油三酯（TG）、血清高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C），根据TC水平随机分为4组，每组10只。

在X、Y两个样品的基础上，另设一个高脂模型对照组和一个基础饲料对照组。经口给予受试物，灌胃量10 mL/kg BW。连续给予30 d。

试验期内两个受试组给予受试饲料1和受试饲料2，高脂模型对照组给予高脂饲料，基础饲料对照组给予基础饲料。于试验结束禁食16 h后取血，测血清TC、TG、HDL-C三项指标。

1.2.5 测定项目与方法

β-葡聚糖含量：按NT/Y 2006—2011《谷物及其制品中β-葡聚糖含量的测定》[13]中的方法进行测定。

莫纳可林含量：将不同条件下的发酵原液置于60℃干燥至恒重，研磨过80目筛，取5 g样品，用100 mL乙醇索氏提取器提取1 h，减压浓缩至5 mL，过滤，清液为待分析样品。采用高效液相色谱法[14]测定。

1.2.6 数据处理

试验数据以测定3次得到的x¯±s表示。采用Origin 8.0进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 蒸煮温度对红曲霉发酵的影响

熟化可以让组织变软，利于后期发酵，但由于熟化温度不够，淀粉等大分子物质也会分解不完全，对于青稞产品，则不利于β-葡聚糖的累积。由图1可见，随着蒸煮温度的升高，β-葡聚糖含量和莫纳可林含量均呈现增加的趋势，且在110～120℃时随着温度的升高，其含量增长较快，说明在此阶段温度的升高对青稞中有效成分溶出的影响很大，但从120～130℃增速缓慢，130～140℃增速趋于平缓，说明此阶段有效成分已经趋于饱和，再升高温度影响不大，且会增加成本。

图1 蒸煮温度对红曲霉发酵的影响Fig.1 Effects of cooking temperatures on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.2 发酵温度对红曲霉发酵的影响

由图2可见，β-葡聚糖含量和莫纳可林含量随着发酵温度的升高，呈现先增加后降低的趋势，其中当发酵温度为35℃时，β-葡聚糖和莫纳可林的含量达到最大，分别为6.12%和2.96 mg/g。

图2 发酵温度对红曲霉发酵的影响Fig.2 Effects of fermentation temperatures on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.3 振荡频率对红曲霉发酵的影响

由图3可知，随着振荡频率的增大，β-葡聚糖和莫纳可林含量呈现先增加后降低的趋势。红曲霉菌为好氧型丝状霉菌，发酵液中的氧气含量直接影响红曲霉的生长和次级代谢产物的合成，因此在发酵过程中不断通入氧气有利于其生长和代谢产物的蓄积，但是转速过高时会产生一定的剪切力，杀伤红曲霉，造成其代谢产物产量下降[15]。当振荡频率为150 r/min时，β-葡聚糖和莫纳可林的含量达到最高值，分别为6.15%和2.95 mg/g。

图3 振荡频率对红曲霉发酵的影响Fig.3 Effects of oscillatory frequency on fermentation of Monascus purpureus Went

2.1.4 接种量对红曲霉发酵的影响

由图4可见，随着接种量的增大，β-葡聚糖和莫纳可林含量呈现先增加后降低的趋势，其中在接种量为6%时达到最大，此时β-葡聚糖含量为6.27%，莫纳可林含量为3.12 mg/g。这可能是由于在接种量小时，营养物质丰富适合微生物的生长繁殖，但是其基数小，不利于次级产物的积累，接种量大时，受限于霉菌本身的特性，次级代谢产物的产量只会在最大值处波动，且后期的代谢产物会对莫纳可林的积累产生阻遏作用。

图4 接种量对红曲霉发酵的影响Fig.4 Effects of inoculation amounts on fermentation of Monascus purpureus Went

2.2 正交优化试验结果

根据单因素试验的结果，为获得最佳红曲霉菌发酵条件，选取蒸煮温度、发酵温度、振荡频率和接种量为主要考察因素进行L9(34)正交试验设计，以发酵醪中的莫纳可林含量作为主要评价指标，β-葡聚糖作为次要评价指标，其权重系数分别为60%和40%。正交试验结果如表2所示。

表2 正交试验结果Table 2 Orthogonal test results

由表2可见，最优条件为A2B2C2D2，即蒸煮温度120℃，发酵温度30℃，振荡恒温培养箱的摇床转速150 r/min，接种量6%。由极差R值可以看出，4个因素影响顺序由大到小为：A＞C＞B＞D，即蒸煮温度＞振荡恒温培养箱的摇床转速＞发酵温度＞接种量，并且蒸煮温度为最主要影响因素。

在此最佳条件下做验证试验，得到β-葡聚糖和莫纳可林的含量达到最高值，分别为6.32%和3.15 mg/g。

2.3 不同β-葡聚糖和莫纳可林含量制品的降血脂效果评价

β-葡聚糖和莫纳可林含量制品饲养小鼠后的降血脂效果见表3和表4。

由表3与表4分析可知，高脂饲料组小鼠的体重、TG和TC显著高于基础饲料组（P＜0.05），受试饲料1、受试饲料2与基础饲料组相比，各指标间的显著差异性各有不同。但从整体上看，受试饲料2组在降低小鼠甘油三酯、总胆固醇以及提高高密度脂蛋白胆固醇上不如受试饲料1组好，说明采用最优发酵条件所制得的产物制作的青稞酵素含片，比直接混合β-葡聚糖和莫纳可林效果好。

表3 不同β-葡聚糖和莫纳可林含量制品对小鼠体重的影响Table 3 Effects of differentβ-glucan and monacolin contents products on body weights of mice 单位：g

表4 不同β-葡聚糖和莫纳可林含量制品对小鼠甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇的影响Table 4 Effects of differentβ-glucan and monacolin contents products on TG,TC and HDL-C contents of mice 单位：mmol/L

3 结论

（1）采用先乳酸菌发酵后红曲霉发酵的方式，通过乳酸菌发酵对环境的改变，为红曲霉提供最适发酵条件，提高了红曲霉次级代谢产物莫纳可林含量。其次级代谢产物莫纳可林有降胆固醇、降血脂的作用。因此，发酵过程引入红曲霉进行发酵，将会强化青稞的降血脂功能。

（2）乳酸菌发酵产物可促进肠胃蠕动，增进吸收；同时，也有一定的降血脂功能。最重要的是，乳酸菌发酵可调节发酵液pH，为红曲霉的生长提供有利的环境，所以，利用乳酸菌和红曲霉发酵是必要的。同时，这种前者发酵产物作为后者发酵条件的工艺是一种新的尝试，为混合发酵提供了新的方法。

（3）红曲霉发酵的最佳条件为：蒸煮温度120℃，发酵温度30℃，振荡恒温培养箱的摇床转速150 r/min，接种量6%。在此工艺下得到的β-葡聚糖和莫纳可林的含量达到最高值，分别为6.32%和3.15 mg/g。在此条件下制作的青稞酵素含片，比直接混合β-葡聚糖和莫纳可林的降脂效果好。