史 婷，刘 伟，许 弯，胡德宜，张菊华，*

（1.湖南大学研究生院隆平分院，湖南 长沙 410125；2.湖南省农业科学院农产品加工研究所，湖南 长沙 410125；3.湖南省火辣辣食品有限公司，湖南 宁乡 410600）

辣椒富含多酚、VB1、VB2、类黄酮、矿物质等营养成分，能有效预防高血压、糖尿病等疾病[1]。近年来的研究表明，辣椒中的辣椒红素具有预防老化、诱导癌细胞凋亡[2]、缓解疼痛[3]的功效。剁辣椒是湖南省的一种特色腌菜及传统调味品，辣椒剁碎后经过自然发酵加工制成的剁辣椒，口感鲜辣脆爽，易消化又能使食欲增强，深受大家喜爱。剁辣椒目前大多采用自然发酵，发酵时间久、易受污染、发酵结果不可控，严重影响了剁辣椒生产的规模化和标准化。

果蔬发酵制品中乳酸菌的筛选及功能活性评价已成为国内外的研究热点。目前已开展了泡菜、刺山柑、辣椒等发酵蔬菜高蛋白酶活性、降胆固醇等功能乳酸菌的筛选，且对其自由基清除能力、耐酸耐胆盐等方面进行抗氧化体系评价[4-5]。Wang等[6]采用高通量测序分析了剁辣椒发酵过程中细菌群落的动态和多样性，得出乳酸菌是起主要作用的微生物。乳酸菌不仅可抑制腐败菌的生长，产生独特的风味物质，还能调节肠道内菌群平衡[7-8]、抗衰老[9]、防治抑郁症[10]等。乳酸菌作为新型抗氧化剂在食品加工中的应用已备受关注。国内抗氧化乳酸菌的筛选已有一些研究，如夏海燕等[11]从酢辣椒筛选出的短乳杆菌L3-5和发酵乳杆菌17-1具有较强的抗氧化能力；黄煜等[12]从皖北地区腌制菜中筛选出的菌株7-1的抗氧化能力比较强；肖宇等[13]从藏灵菇中筛选出优势菌-开菲尔乳杆菌具有较强的抗氧化活性。目前所筛选的菌株存在发酵环境适应性差、单菌种发酵加工产品风味不足、品质参差不齐等问题。多菌种发酵具有发酵快、风味浓郁等特点[14]，本研究拟通过乳酸菌的抗氧化能力初筛（H2O2耐受性）和复筛（羟自由基清除能力、还原能力、超氧阴离子清除能力、DPPH自由基清除能力），获得抗氧化功能较强的菌株应用于辣椒的发酵，以期为多菌种工业化生产剁辣椒提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与设备

1.1.1 材料与试剂

黄贡椒：产地为湖南省衡阳市衡东县三樟镇；七星椒：产地为湖南省常德市桃源县牛车河镇；三味椒：产地为湖南省永州市新田县陶岭乡；大冲辣椒：产地为湖南省郴州市临武县水东镇；博辣红牛：产地为湖南省武冈市邓家铺镇；博辣艳丽、小米椒、湘研28号、长辣7号、二荆条、朝天椒：产地为湖南省长沙市长沙县黄花镇。

植物乳杆菌及嗜酸乳杆菌：北京北纳创联生物技术研究院；MRS固体培养基和MRS液体培养基：青岛海博生物科技有限公司；氢氧化钠：南京化学试剂股份有限公司；碳酸钙：天津金汇太亚化学试剂有限公司；无水乙醇：郑州派尼化学试剂厂；邻菲啰啉：上海市源叶生物有限公司；磷酸缓冲盐溶液（PBS）：上海科汇生物技术有限公司；铁氰化钾、三氯乙酸、Tris-HCl、二乙三胺五乙酸、邻苯三酚，购自国药集团化学试剂有限公司。

1.1.2 仪器与设备

SW-CJ-1C型超净工作台：北京永康乐业科技发展有限公司；UV-1800型紫外可见分光光度计：深圳市珺煌科技有限公司；MC-D500U（E）/PH-HK显微镜：凤凰光学股份有限公司；LDZM-80L-III型灭菌锅：安徽正华生物仪器设备有限公司；Avanti J-26XP冷冻离心机：美国Beckman公司；TARE-ZERO电子天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；PHS-3C型pH计：上海仪电科学仪器股份有限公司；BSA124S分析天平：赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；WP-UPWF-20超纯水制备机：北京沃特尔水处理设备有限公司。

1.2 方法

1.2.1 自然发酵剁辣椒中菌株的分离纯化

以大冲辣椒、博辣红牛、博辣艳丽等10种不同产地的辣椒为原料，经清洗晾干后剁碎，添加8%食盐，混匀后分别装坛发酵1个月。经自然发酵，分别称重10 g，并放入装有90 mL无菌生理盐水的三角瓶中，依次梯度稀释成10-3、10-4、10-5、10-6，然后，每梯度取1 mL均匀涂布在有碳酸钙的MRS固体培养基，置于37℃培养箱中2～3 d。挑取有钙溶圈的单个菌落，进行平板划线分离纯化2～3次。对可能的乳酸菌菌株进行革兰氏染色，再用显微镜观察，过氧化氢接触酶试验，对革兰氏阳性、无芽孢和接触酶阴性的菌株斜面和甘油管进行冷冻保存（菌液和50%甘油按1∶1比例保存）[15]。

1.2.2 高效产酸乳酸菌初筛与复筛

单个菌落纯化后，接种在5 mL的MRS液体培养基中，37℃恒温培养箱培养，24 h后用紫外可见分光光度计在600 nm处测得OD值，测得每个待测菌株发酵液中的pH，综合选取OD值相对较高且pH相对较低的菌株，接种在MRS固体培养基上，置于37℃恒温培养箱培养2～3 d，再挑取单菌落于液体培养基中培养24 h，吸出1 mL发酵液加50 mL无菌蒸馏水稀释，采用0.1 mol/L的NaOH溶液测总酸含量，每组滴定做3次平行，选取产酸量高的菌株。

1.2.3 抗氧化乳酸菌初筛

1.2.3.1 具有抗过氧化氢能力乳酸菌的初筛

将获得的高效产酸乳酸菌进行纯化，挑取单菌落接种至H2O2浓度为15 mmol/L的MRS培养基中，37℃恒温培养2 h，吸取100μL在平板中进行涂布，37℃培养箱培养48 h，观察并读取活菌落数[16-17]。

1.2.3.2 完整细胞及无细胞提取物的制备

将具有H2O2耐受性的乳酸菌菌株进行纯化，挑取单菌落接种至MRS培养液中，放入37℃恒温培养箱，24 h后离心5 min，把菌体底层沉淀收集起来用无菌水冲洗3次，将菌体细胞重悬，浓度调为109CFU/mL。取其中部分菌悬液用于完整细胞（Intact cells，IC），剩下的用超声机冰浴破碎其完整菌体，离心10 min，收集上清液作为无细胞提取物（Cell free extracts，CFE）。

1.2.4 抗氧化乳酸菌复筛

1.2.4.1 总抗氧化能力（FRAP法）

吸取1%铁氰化钾和0.2 mol/L磷酸缓冲液各0.5 mL，加入到体积为0.5 mL的待测样品中混匀，在50℃的水浴中反应20 min，立即冷却。再加0.5 mL的10%三氯乙酸，离心10 min，取上清液1 mL，分别加入1 mL蒸馏水和0.1%FeCl3溶液，混和均匀，静置10 min。测定700 nm处的吸光度，比较吸光度值大小，值越大表明还原能力越强。

1.2.4.2 DPPH自由基清除能力

吸取1 mL样品、2 mL 0.2 mmol/L的DPPH无水乙醇溶液于10 mL离心管中混匀，静置30 min，以10 000 r/min速度离心1 min，测出上清液在517 nm波长处的吸光度Ai。用等体积无水乙醇代替DPPH溶液测定吸光度Aj，用等体积蒸馏水代替样品溶液测定吸光度A0[18]。DPPH自由基清除率计算公式为：

1.2.4.3 超氧阴离子自由基（O2·）清除能力

取3 mL浓度为50 mmol/L Tris-HCl（pH 8.2）、1 mL二乙三胺五乙酸、1 mL邻苯三酚、0.5 mL待测样品，依次加入离心管，混合均匀后放入25℃的培养箱反应10 min，测得325 nm波长处的吸光度[19]。不含待测物和邻苯三酚的吸光度记为A0；A1为不含待测物、含邻苯三酚的吸光度；A2为含待测物、不含邻苯三酚的吸光度；A3为含待测物和邻苯三酚的吸光度。O2·清除率计算公式为：

1.2.4.4 羟自由基清除能力

取0.75 mmol/L的邻菲啰啉1 mL放入试管中，依次加入2 mL pH为7.4的PBS和1 mL蒸馏水，拌匀，加入1 mL浓度2.5 mmol/L的FeSO4溶液，混合均匀，加l mL 0.12%H2O2，37℃水浴1.5 h，检测其在536 nm波长处的吸光度Ap；吸光度Ab为用1 mL蒸馏水代替H2O2检测的吸光度；吸光度As为用1 mL样品代替1 mL的蒸馏水检测的吸光度[20]。·OH清除率计算公式为：

1.2.5 菌株的鉴定

将斜面保存的乳酸菌在平板上涂布，37℃培养2～3 d，观察菌落形态，把制成的菌悬液放在10×100倍显微镜下，观察菌株形态。

对筛选的乳酸菌提取总DNA，进行PCR扩增，引物27F：5’-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3’，1492R：5’GGTTACCTTGTTACGACTT-3’，PCR反 应 体 系：Mix 25μL，模板DNA 1μL，1492R 2μL，27F 2μL，ddH2O 20μL；PCR扩增条件：94℃2 min；55℃50 s、94℃45 s、72℃2 min，经30个循环；72℃10 min；4℃条件下延伸60 min。产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测，纯化后送至生工生物工程（上海）公司测序。在NCBI的BLAST程序中比较测序结果，并用MEGA 4.0软件构建同源序列系统发育树。

1.2.6 乳酸菌发酵辣椒制作工艺

1.2.6.1 菌种复合比例

根据前期试验研究结果，发酵乳杆菌BLHN3不仅具有良好的产香性能，而且抗氧化功能表现突出。将BLHN3结合具有保健功能的嗜酸乳杆菌和产酸性能较好的植物乳杆菌接种剁辣椒发酵，3种菌的比例为1∶1∶1。

1.2.6.2 工艺流程

1.2.7 单因素试验设计

1.2.7.1 接种量试验

按照低盐发酵辣椒工艺制作，固定食盐添加量6%，温度28℃，发酵时间10 d，接种量分别为1%、2%、3%、4%、5%，测定剁辣椒总酸含量，并对辣椒进行感官评价。

1.2.7.2 食盐添加量试验

按照低盐发酵辣椒工艺制作，固定接种量3%，温度28℃，发酵时间10 d，食盐添加量分别为2%、4%、6%、8%、10%，测定剁辣椒总酸含量，并对辣椒进行感官评价。

1.2.7.3 发酵温度试验

按照低盐发酵辣椒工艺制作，固定接种量3%，食盐添加量6%，发酵时间10 d，发酵温度分别为22、25、28、31、34℃，测定剁辣椒总酸含量，并对辣椒进行感官评价。

1.2.7.4 发酵时间试验

按照低盐发酵辣椒工艺制作，固定食盐添加量6%，温度28℃，接种量3%，发酵时间分别为6、8、10、12、14 d，检测剁辣椒总酸含量，并对辣椒进行感官评价。

1.2.8 发酵工艺正交试验设计

在单因素试验结果的基础上，以接种量、食盐添加量、发酵温度、发酵时间为考察变量，以总酸含量及感官评价为考察指标，进行四因素三水平正交试验，因素水平如表1所示。

表1 正交试验因素水平表Table 1 Levels and design factors of orthogonal experiment

1.2.9 测定项目与方法

1.2.9.1 总酸含量

参照GB/T 12456—2008[21]中的方法测定。

1.2.9.2 感官评价

邀请10位有经验的人员组成评价小组，分别从形态、色泽、风味和脆度4个主特征对剁辣椒进行感官评价，评分标准见表2。

1.2.10 数据处理

通过SPSS 17.0软件分析数据，结果用x¯±s表示，显著性差异比较通过单因素方差分析得出；采用Origin 8.5绘制图表。所有试验重复3次。使用MEGA 4.0软件构建同源序列系统发育树。

2 结果与分析

2.1 高效产酸乳酸菌的筛选

产酸能力是评价乳酸菌的基本标准之一，菌株对酸有较好的耐受性才能在胃酸环境下维持较好的活性，提高在肠道中的存活能力。以自制的剁辣椒为原料，通过分离纯化、镜检和接触酶试验，共得到54株乳酸菌。乳酸菌的耐低酸特性也是其抗氧化的重要前提[22]，通过比较各菌株发酵液的OD600值和pH，初筛得到产酸能力较强的BLHN3、CL7-3、DC2等11株菌，OD值均在1.0以上，pH均小于4.5，活性较好。由图1可知，乳酸菌BLHN3、EJT2、PDJ1的发酵液总酸含量显著高于其他菌株（P＜0.05），其中菌株BLHN3和PDJ1的总酸含量较高，且差异不显著，分别为1.34%和1.31%。可得出BLHN3、EJT2、PDJ1等11株具有较好的耐酸性，为下一步进行抗氧化性乳酸菌筛选提供了基础。

2.2 抗氧化能力初筛

为避免受到高浓度氧化剂的危害，采用低浓度1 mmol/L H2O2处理微生物细胞，这是因为氧化剂会刺激细胞体的防御系统从而产出各种酶，使他们能够对氧化剂有耐受性[23]。为提高具有抗氧化性能菌株的筛选效率，将筛出的高效产酸的11株乳酸菌进行H2O2耐受性试验，选取革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性及可在固体平板上生长的菌，试验结果如表3所示，初步确定BLHN3、EJT2、PDJ1等对H2O2具有强耐受性。

图1 不同乳酸菌产酸能力的比较Fig.1 Comparison of acid production abilities of different lactic acid bacteria

表3 耐受H2O2乳酸菌初筛结果Table 3 Primary screening results of lactic acid bacteria resistant to H2O2

2.3 抗氧化能力复筛

2.3.1 FRAP还原能力

有研究证明，还原能力与抗氧化性之间存在着一些相关性，可作为评价具有潜在抗氧化性的指标。由图2可知，具有强耐受H2O2的5株乳酸菌均有还原能力。整体来看，5株菌的菌体细胞（IC）的还原能力均大于无细胞提取物（CFE），证实5株乳酸菌中具有还原能力的物质主要存在于菌体内。各菌株的IC组还原能力范围35.56%～61.70%，CFE组还原能力范围22.41%～43.79%，BLHN3的IC组和CFE组相比其他菌株还原能力最强，IC组还原能力达到61.70%，CFE组的还原能力达到43.79%。其次PDJ1和EJT2菌株还原能力较高，XM2的还原能力最弱。有完整细胞的菌体自身存在氧化还原调节系统，且这些还原能力较强的菌株也已表明具有保护细胞免受氧化衰老的效果[24]。

图2 各菌株的还原能力比较Fig.2 Reducing ability comparison of each strain

2.3.2 DPPH自由基清除能力

DPPH紫外分光光度法基于清除剂存在时，DPPH自由基可接受一个电子或氢原子，形成可使溶液变色的原理，被用来评价抗氧化能力及筛选具有抗氧化活性的乳酸菌菌株，该法方便快捷、灵敏且重复性好。DPPH自由基清除率（包括IC和CFE的DPPH自由基清除率）大于30%可认为是DPPH活性高的乳酸菌[25]。

由图3可见，5株乳酸菌均具有清除DPPH自由基的能力，但清除能力有所不同。BLHN3菌株在IC组和CFE组对DPPH自由基的清除率均最高，分别达到51.60%、31.41%。在IC组中，EJT2和PDJ1菌株对DPPH自由基的清除能力相差不大，XM2清除能力最小。在CFE组中，XY28-3菌株对DPPH自由基的清除率最低，仅为15.39%。表明每株乳酸菌IC组和CFE组的DPPH自由基清除率无对应关系。

图3 各菌株对DPPH自由基的清除效果Fig.3 Scavenging effect of each strain on DPPH free radical

2.3.3 超氧阴离子自由基清除能力

由图4可知，受试乳酸菌清除超氧阴离子自由基的活性物质存在于细胞的不同部位。IC组和CFE组中，5株乳酸菌均对O2·有清除能力。IC组和CFE组中BLHN3菌株O2·清除能力均最高，清除率分别达到43.27%、31.15%，PDJ1、EJT2依次较高。O2·清除能力在不同菌株中有显著差异（P＜0.05）。刘珊春等[26]对18株乳酸菌的超氧阴离子清除率进行测定，最高为28.78%。李丹丹等[27]对7株乳酸菌的超氧阴离子清除率进行测定，最高为26.91%。相比之下，BLHN3菌株O2·清除率更高。

图4 各菌株对O2·的清除效果Fig.4 Scavenging effect of each strain on O2·

2.3.4 羟自由基清除能力

·OH氧化性很强，具有损伤生物膜、降解DNA作用，是造成脂质过氧化及人细胞损伤中最主要的自由基。由于乳酸菌会在自由基与机体内分子发生链式反应，用具有反应活性的羟基自由基作用于活细胞中的损坏细胞避免提前终止自由基的生成。由图5可以看出，5株乳酸菌对·OH都有清除能力。这与刘少敏[28]的结论一致。XY28-3菌株的CFE组对·OH清除能力最小，清除率仅为10.26%。IC组中BLHN3菌株对·OH的清除能力最大，清除率达到35.69%，EJT2和PDJ1次之。CFE组中BLHN3和PDJ1菌株对·OH清除能力较强。

乳酸菌在IC和CFE组之间清除羟基自由基的能力不同。Ren等[29]测定了9株乳酸菌的无细胞悬液中的羟自由基清除率的范围为10.37%～94.26%，其中CGMCC 1.557菌株的OH-IC值最高，为94.26%，其次，CICC 23174菌株的值为73.19%。王帅等[16]通过对IC和CFE中4株高DPPH自由基清除活性乳酸菌（DPPH自由基清除率（IC和CFE）均高于30%）的羟自由基清除能力的测定，得出Kc13在所有测定的菌株中·OH清除率最高，其中CFE组是80.01%和IC组是89.97%。正是由于抗氧化物质在乳酸菌中的种类差异或同种抗氧化物质含量高低，导致不同乳酸菌的羟自由基清除能力差异显著。

图5 各菌株对羟自由基的清除率Fig.5 Scavenging rate of each strain on hydroxyl radical

综上所述，经对DPPH自由基清除能力、还原能力、羟基自由基清除能力及超氧阴离子清除能力评估，BLHN3菌株的抗氧化能力最强。

2.4 BLHN3菌株的鉴定

由图6可以看出，BLHN3菌株的菌落为白色圆形，表面平整，易挑起，φ为1～2 mm；细胞形态为杆状，与乳杆菌的形态特征相吻合。

图6 BLHN3菌株的形态及显微镜观察（10×100）Fig.6 Colony morphology and microscopic observation of BLHN3(10×100)

经分析DNA基因组的PCR产物，电泳图如图7所示，菌株的扩增序列长度均为1 448 bp。

在NCBI中，将获得的碱基序列进行BLAST比对，使用MEGA 4.0构建系统发育树用于同源性分析，结果如图8所示，BLHN3菌株与发酵乳杆菌（Lactobacillus fermentum）的相似度最高，同源性为100.00%。16S rRNA基因序列比对中，属于同一个属的最小同源性为95%，属于同一物种的最小同源性为97%，可以判定菌株为L.fermentum。

图7 PCR产物检测电泳图Fig.7 Electrophoresis of PCR amplified 16SrDNA sequence

图8 菌株BLHN3的16S rDNA系统发育树Fig.8 16S rDNA phylogenetic tree of BLHN3 strain

2.5 发酵工艺单因素试验结果

2.5.1 接种量对剁辣椒的影响

接种量的不同对剁辣椒产酸具有一定的影响，接种量少会延长发酵时间，接种量过多菌株间会产生竞争性抑制。由图9可见，随着接种量的不断增加，剁辣椒的感官评分先升高后降低，当接种量为2%时，剁辣椒的感官评价最高，椒块棱角较分明，粗细较均匀，无霉斑或白花，色泽红亮，香气较好，酸感和咸味均适中，有脆度，口感较好，为最佳接种量。接种量越大，剁辣椒发酵越快，乳酸菌产酸能力越强。接种量在3%～5%时，总酸趋于平缓，说明乳酸菌之间发生竞争性抑制，影响总酸的生成。

2.5.2 食盐添加量对剁辣椒的影响

图9 接种量对剁辣椒总酸与感官评分的影响Fig.9 Effects of inoculation amounts on total acid contents and sensory scores of chopped pepper

食盐添加量过少，难以抑制腐败菌的生长，食盐添加过多，乳酸菌生长减慢，发酵时间增长。由图10可知，剁辣椒的感官评分随食盐添加量的逐渐增加，先升高后缓慢降低，食盐添加量为6%时，达到最高。剁辣椒的总酸随食盐量增加呈下降趋势。综合感官评分及产酸量、成本等因素，确定6%为适宜的食盐添加量。

图10 食盐添加量对剁辣椒总酸与感官评分的影响Fig.10 Effects of salt additions on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

2.5.3 发酵温度对剁辣椒的影响

剁辣椒的风味会受到发酵温度的影响。菌种活化后，总酸、感官评分与不同发酵温度的关系如图11所示，剁辣椒的总酸含量随发酵温度的不断升高逐渐增加。在22～34℃时，剁辣椒的感官评分随温度的升高先增加后降低，发酵温度为28℃时，感官评分达到最高，且椒块棱角色泽红亮，无腐败现象，香气较好，酸感和咸味均适中，有脆度，口感较好，即确定为适宜发酵温度。

图11 温度对剁辣椒总酸与感官评分的影响Fig.11 Effects of temperatures on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

2.5.4 发酵时间对剁辣椒的影响

发酵时间过短，产酸较少，影响挥发性物质的形成，当发酵时间过长时，也会增加成本。由图12可知，发酵时间为10 d时，感官评分达到最高。发酵时间太短或太长，剁辣椒产酸量不同，发酵时间6～10 d，总酸含量为8.53～9.99 g/kg，发酵时间10～14 d，总酸趋于平缓。结合成本考虑，选择10 d为最佳发酵时间。

图12 发酵时间对剁辣椒总酸与感官评分的影响Fig.12 Effects of fermentation times on the total acid contents and sensory scores of chopped pepper

2.6 发酵工艺正交试验结果

由表4可以看出，以感官评分为指标，影响辣椒发酵各因素的主次顺序依次为：接种量＞发酵时间＞食盐添加量＞发酵温度，最佳组合为A2B2C3D1；以总酸含量为评价指标，影响辣椒发酵各因素的主次顺序依次为：发酵温度＞接种量＞发酵时间＞盐添加量，最优组合为A3B1C3D2。综合成本及感官评价考虑，A2B2C3D1为最佳组合，该组合在正交试验中感官评分最高，产酸较适宜。具体发酵工艺为发酵时间10 d，接种量2%，发酵温度26℃，食盐添加量7%，剁辣椒总酸含量为9.32 g/kg，感官评分82.89分。

3 结论

通过对自制剁辣椒中乳酸菌筛选，获得产酸能力较强的11株菌进行抗氧化试验，经过H2O2耐受性初筛，BLHN3、EJT2、PDJ1、XM2、XY28-3等对H2O2具有较强耐受性。5株菌的抗氧化能力评价中BLHN3菌株的综合抗氧化能力最强，经鉴定为发酵乳杆菌。以筛选出的发酵乳杆菌结合嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌开展多菌种复合发酵剁辣椒，在单因素试验的基础上，通过正交试验确定最佳工艺为：发酵时间10 d，接种量2%，发酵温度26℃，食盐添加量7%，该工艺制备的剁辣椒色泽红亮，无霉斑或白花，香气较好，酸感和咸味均适中，脆度、口感较好，总酸含量为9.32 g/kg，感官评分82.89分。本研究结果可为抗氧化功能乳酸菌的筛选及工业化多菌种发酵辣椒提供参考，在以后的研究工作中将会结合细胞模型和体内试验对BLHN3菌株及其发酵产品的抗氧化机制做更深入的研究，以期为BLHN3发酵乳杆菌的开发和应用奠定基础。

表4 发酵工艺正交试验结果Table 4 Orthogonal test results of fermentation process