聂子页， 王丹丹， 周振芳， 张娇娇， 刘鸿艳， 林 田， 吴文嫱

(1.海南大学热带作物学院， 海口 570228； 2.海南大学生命科学与药学院， 海口 570228； 3.上海市农业生物基因中心， 上海 201106)

参薯(DioscoreaalataL.)又名大薯、脚板薯、菜山药，隶属于薯蓣科薯蓣属周生翅组缠绕草质藤本植物[1]。参薯在我国主要分布在长江以南，其块茎富含蛋白质、淀粉等营养物质[2]，是我国传统的蔬菜，是非洲热带地区的主粮[3]。其茎叶含较高的粗蛋白(19.55%)和较低的单宁(0.66%)，可用作饲料[4]。由于参薯长期依靠地下块茎无性繁殖，导致生产中病害逐年累积、种性下降、种质资源逐渐灭绝，通过离体组织培养可以保存珍贵的资源[5]。然而随着资源收集数量的增加，离体保存需要投入较大的人力物力，通过限制生长保存可以减少继代次数，节省劳力。

表2 培养150 d时Da 70在不同蔗糖浓度处理下的生长抑制情况

延缓植物生长的主要方法有：添加不同生长抑制剂和不同高渗物质、调整培养基成分以及降低培养温度等[6]。目前，已经有许多块茎类植物探讨了相关限制植物生长保存的研究，如：马铃薯[7]、山药[8-9]、黄独[10]等。国外报道了在不同ABA、甘露醇、山梨醇浓度处理下对参薯缓慢生长影响的研究[11]，国内未见相关报道。常使用的高渗物质有蔗糖、甘露醇、山梨醇等[12]。本研究拟通过添加蔗糖、甘露醇和山梨醇3种不同浓度的高渗物质，提高培养基渗透势负值，研究在不同浓度水平下，对参薯离体保存植株的存活率及生长状况的影响，为建立参薯离体种质资源中期保存提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料

实验材料为海南大学薯蓣课题组提供的参薯70号(Da 70，云南瑞丽)组培苗，蔗糖、甘露醇、山梨醇分别购自西陇科学、Solarbio、Biofroxx。

1.2 方 法

以MS+3%蔗糖+0.7%琼脂+0.1%PVP为基础培养基，将Da 70材料接种到添加不同浓度蔗糖、甘露醇、山梨醇的基础培养基上进行限制生长，浓度设置见表1。在光照12 h·d-1，温度(25±2)℃下培养，30 d、60 d、90 d、150 d记录苗株高、叶片数及存活率。观察不同处理对材料生长限制的影响。每个处理3个重复。

1.3 数据处理分析

采用SPSS 23.0软件和Microsoft Excel 2010软件进行数据处理和分析，实验数据均为平均值±SD。

2 结果与分析

2.1 不同蔗糖浓度对参薯Da 70试管苗限制生长的影响

采用5个不同蔗糖浓度处理Da 70带芽茎段，研究结果表明，室温下10～70 g·L-1范围内，随着蔗糖浓度的升高，试管苗的生长加快。在培养30～150 d，10 g·L-1蔗糖处理的不同阶段，试管苗株高均低于其他处理，其中在90～150 d时显著低于其他处理。在培养30～90 d，50 g·L-1和70 g·L-1蔗糖处理的试管苗生长迅速且株高显著高于对照，尤其在60～90 d，株高差异更显著；在150 d时，试管苗置顶，高度差异无法比较(图1、图2)。在培养150 d时，不同处理的试管苗生长状态和存活率有显著差异。10 g·L-1蔗糖处理时，试管苗的叶片较小，颜色保持嫩绿；50 g·L-1和70 g·L-1蔗糖处理时，试管苗多数死亡，存活率显著下降(表2)。表明低浓度蔗糖处理能够有效抑制Da 70生长，延长生长时间；在高浓度蔗糖处理下，则会促进试管苗的生长，并加快早衰或死亡。

表1 不同浓度高渗物质处理

2.2 不同甘露醇浓度对参薯Da 70试管苗限制生长的影响

采用5个不同浓度甘露醇处理Da 70带芽茎段，研究结果表明，室温下，0～40 g·L-1范围内，随着甘露醇浓度的升高，试管苗生长减慢。在培养30～150 d，30 g·L-1和40 g·L-1甘露醇处理的试管苗生长缓慢，且显著低于对照以及其他处理，尤其在60～90 d，生长较慢(图3、图4)。在培养150 d时，不同浓度处理的试管苗生长状态有显著差异，在0～30 g·L-1浓度范围内，试管苗存活率高且无显著差异，在40 g·L-1甘露醇处理下，试管苗存活率显著下降。在30 g·L-1甘露醇处理下，试管苗的叶片较小，颜色保持嫩绿。综合试管苗株高、存活率及生长状态，30 g·L-1处理的试管苗明显优于40 g·L-1处理的试管苗(表3)。表明高浓度甘露醇处理能有效抑制Da 70试管苗生长，延长生长时间。

注：同时间段上不同字母表示差异显著(p<0.05)。下同。

图2 培养150 d时不同蔗糖浓度处理对Da 70的影响

表3 培养150 d时Da 70在不同甘露醇浓度处理下的生长抑制情况

表4 培养150 d时Da 70在不同山梨醇浓度处理下的生长抑制情况

图3 不同甘露醇浓度对Da 70的影响

2.3 不同山梨醇浓度对参薯Da 70试管苗限制生长的影响

采用5个不同山梨醇浓度处理Da 70带芽茎段，研究结果表明，室温下 0～40 g·L-1范围内，随着山梨醇浓度的升高，试管苗的株高以及存活率没有显著变化(表4、图5)。表明不同山梨醇浓度的处理并未抑制Da 70试管苗的生长。

图4 培养150 d时不同甘露醇浓度处理对Da 70的影响

图5 培养150 d时不同山梨醇浓度处理对Da 70的影响

3 讨 论

本研究中，10 g·L-1、20 g·L-1蔗糖浓度处理能够有效延缓植株生长，而高浓度蔗糖处理不利于参薯中期保存，这与山药研究结果相似，在0.5%和1%蔗糖处理时幼苗生长显著减缓[12]。但与马铃薯研究结果不同，10%蔗糖高浓度可延长马铃薯保存时间有效抑制其生长，且存活率达90%以上[13]。高浓度的蔗糖在参薯中并未起到渗透压调节的作用。随着蔗糖浓度的增加，反而促进参薯的快速生长，在高浓度(70 g·L-1)蔗糖处理下，依旧没有抑制参薯试管苗的生长，这将有助于提高参薯的生物量。今后可以继续加大蔗糖使用量来研究其对参薯限制生长的高浓度临界值。

30 g·L-1和40 g·L-1甘露醇处理均能有效延缓植株生长，且促进参薯不定芽的分化。而在存活率上，40 g·L-1的处理显著低于30 g·L-1的处理。在Villaluz等[11]的研究中，描述了在甘露醇处理下参薯试管苗根长和芽分化的状态，并表明4%甘露醇处理能有效抑制参薯的生长，且在恢复后的盆栽试验中发现，4%甘露醇处理和正常生长的参薯块茎产量相当，但并未详细描述高浓度甘露醇处理的试管苗具体的生长状态及存活率。Sanghamitr等[12]的研究表明，山药随着甘露醇浓度从0增加至5%，植株生长受限，且叶片形态异常，并分化出许多不定芽，这与李润等[14]研究的不同甘露醇浓度对马铃薯离体保存的影响结果一致。

高浓度山梨醇溶液处理并不能延缓参薯植株生长，在Villaluz等[11]的研究中，7%山梨醇溶液处理能够有效减缓参薯植株生长，但是4%山梨醇溶液处理并未延缓植株生长。因此，今后可以继续加大山梨醇的使用量来研究其对参薯限制生长的影响。

限制生长保存主要有降低温度、调整培养基养分、调节渗透压以及添加生长调节剂等方法，降低细胞的生长速度但不会造成死亡，以此达到保存种质资源的目的，延长继代的时间[15]。结果表明，除山梨醇外，降低蔗糖浓度和添加甘露醇均能有效的延长试管苗继代时间，并且植株高度也显著降低。目前，参薯试管苗中期保存统计时间为5个月，保存时间相对较短，有待进一步观察保存更长时间的生长抑制情况。限制生长保存的研究除了添加高渗物质外，还可在培养基中添加比久、多效唑、脱落酸、嘧啶醇等生长抑制剂。添加生长抑制剂的研究报道主要集中在马铃薯[7]、木薯[16]、芋头[17]等物种上，尚未见有关参薯的国内外研究报道，今后可以使用生长抑制剂研究中长期保存。