王鼎 徐晓玲 朱冠霞 程国平 毛伟敏

根据2015年版WHO肺癌分类标准，肺浸润性黏液腺癌（invasive mucinous adenocarcinoma，IMA）是腺癌的一种少见亚型[1]，仅占所有肺腺癌的1.5%～10%[2-4]。IMA具有独特的遗传和生存特征，与非黏液腺癌（nonmucinous adenocarcinoma，NMA）相比，IMA 预后更差，且缺乏有效的治疗手段[4-5]。此外，IMA的基因突变谱以及免疫检查点状态也与NMA有所不同[6-7]。而表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR）和间变性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase，ALK）是肺腺癌中重要的治疗靶点[8]，针对IMA这个特殊的肺腺癌亚型，本研究旨在探讨EGFR基因突变和ALK重排在IMA中的表达及与临床病理特征的关系。

1 对象和方法

1.1 对象 选取2010年1月至2015年12月中国科学院大学附属肿瘤医院收治的IMA患者101例。其中穿刺样本13例，手术样本88例；男49例（48.5%），女52例（51.5%）；年龄 29～79（57.86±9.1）岁，≥58岁 53例（52.5%），＜58岁 48例（47.5%）；有吸烟史 40例（39.6%），无吸烟史61例（60.4%）；黏液腺癌类型：纯黏液腺癌 61例（60.4%），混合癌40例（39.6%）；T分期：Tx 8例（7.9%），T127例（26.7%），T257例（56.4%），T35例（5.0%），T44例（4.0%）；N 分期：Nx 9例（8.9%），N059例（58.4%），N17例（6.9%），N223例（22.8%），N33例（3.0%）；M分期：有远处转移13例（12.9%），无远处转移88例（87.1%）；有脉管瘤栓11例（12.9%），无脉管癌栓90例（85.1%）；有神经浸润7例（6.9%），无神经浸润94例（93.1%）。纳入标准：（1）穿刺样本及手术样本的病理诊断结果均为IMA，且患者病历资料完整；（2）若为手术样本，则术前未行放化疗、生物治疗或免疫治疗等抗肿瘤治疗。排除标准：（1）5年内同时患有其他类型的恶性肿瘤患者；（2）其他瘤种转移而来的患者；（3）术前行新辅助化疗的患者。收集所有患者手术切除的肺癌组织标本或穿刺活检标本，4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。101例患者中共 67例行EGFR和（或）ALK检测，其中EGFR/ALK均行检测32例，仅行EGFR检测20例，仅行ALK检测15例；未参与检测34例。

1.2 方法

1.2.1 EGFR基因突变检测 应用突变扩增系统PCR法。根据FFPE DNA提取试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）说明书分离和纯化肿瘤组织中的DNA。随后使用人类EGFR基因突变检测试剂盒（厦门艾德生物医药科技股份有限公司）鉴定EGFR基因突变，检测位点为EGFR基因中的18-21外显子。PCR如下进行：95℃ 5 min进行初始温育，47个循环，95℃持续25 s，93℃持续25 s。严格按照说明书进行结果判定，如果扩增循环数（cycle threshold，Ct）值为 0 或 Ct值＞30，则实验结果判为野生型，反之则为突变型。

1.2.2 ALK重排阳性的检测和评估 应用VENTANA ALK免疫组化法。石蜡样本4 μm厚连续切片，烤箱烘干。ALK表达的免疫组化染色在Benchmark XT自动染色系统（美国罗氏公司）中进行。兔ALK单克隆抗体（D5F3）（美国文塔纳医疗系统公司）孵育15 min，使用具有信号放大的Optiview DAB免疫组化检测试剂盒（瑞士罗氏公司）进行检测。由两位经验丰富的病理学医生进行独立判读，细胞质中具有颗粒状结构的强烈棕色染色判读为ALK阳性，而微弱的细胞质染色判读为阴性。若两者判读结果不一致时则两位病理医师进行共同阅片，商议后做出一致决定。

1.3 统计学处理 采用SPSS 20.0统计软件。计数资料组间比较采用x2检验或Fisher确切概率法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

52例行EGFR检测的IMA患者中，EGFR突变阳性率为23.1%（12/52）；47例行ALK检测的IMA患者中，ALK重排阳性率为27.7%（13/47）；32例EGFR/ALK均行检测的IMA患者中，仅1例（3.1%）EGFR/ALK检测同时阳性。EGFR基因突变仅与性别有关，在女性患者中表达率更高（P＜0.05），而与年龄、吸烟史、黏液腺癌类型、T分期、N分期、M分期、脉管瘤栓和神经浸润均无关（均P＞0.05）。ALK重排阳性仅与T分期有关，T分期越高越倾向于发生ALK重排（P＜0.05），而与性别、年龄、吸烟史、黏液腺癌类型、N分期、M分期、脉管瘤栓和神经浸润均无关（均P＞0.05），见表1。

表1 EGFR突变和ALK重排与IMA患者的临床病理特征的关系（例）

3 讨论

由于IMA是肺腺癌中的少见类型，目前，全球针对IMA的研究尚少。IMA的分子表达谱与其他类型的肺腺癌不尽相同，最近的高通量分析揭示了IMA中的几种基因异常，包括鼠类肉瘤病毒癌基因（KRAS）、B-Raf原癌基因丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（BRAF）、ERBB2和磷脂酰肌醇-3-激酶α亚单位（PI3KCA）突变以及神经调节素 1（NRG1）、NTRK1、ALK、RET 和 ERBB4 重排[9-10]。EGFR突变在IMA中相对少见，仅0%～5%[9-10]。以往研究显示，靶向治疗EGFR突变或ALK重排的肺腺癌具有不错的疗效，但针对IMA的疗效数据仍有限[11]。此外，IMA很少出现p53突变，与NMA相比肿瘤负荷更低[10]。IMA主要发生在非重度吸烟者中，很少表达程序性死亡配体-1（PD-L1）[12-14]。但这些研究样本量都太小，需要进一步验证。

本研究结果显示，IMA患者中吸烟比例为39.6%（40/101），而Duruisseaux等[15]报道的25例IMA患者中吸烟比例达 60%（15/25），Yoshizawa等[16]报道的 13 例IMA患者中吸烟比例达76.9%（10/13），因此吸烟与IMA之间的相关性仍需更大样本量的研究。本研究中，IMA患者的EGFR突变更常见于女性，这与Wang等[17]对于肺腺癌的研究相一致。此外，ALK重排更常见于T分期更高的患者。因此对于T分期偏高的IMA患者，更应进行ALK检测，以免错过黄金位点的治疗机会。在所有进行检测患者中，仅有1例EGFR和ALK检测同时呈阳性的患者，这在Wang等[17]的研究里同样罕见。

本研究为国内少有的大样本IMA相关的回顾性研究，为临床医师对IMA这种少见类型提供了理论参考。研究结果期待更大的样本量、更多中心的研究来进一步验证。