谭八梅 王 荦 裴泓霖 夏兴龙 丁 君 常亚青 郝振林

(大连海洋大学 农业农村部北方海水增养殖重点实验室 大连 116023)

刺参(Apostichopus japo nicus)是具有较高经济、营养及药用价值的海水养殖生物(陈士国, 2010; Roggatz et al, 2018; 曹荣等, 2020)。池塘养殖作为一种重要的刺参增养殖模式，已经成为刺参养殖产业的重要组成部分(赵艳芳等, 2018)。然而，随着刺参养殖产业的迅速发展，养殖水体的污染问题日益严重，对养殖生物产生了一定危害。

养殖池塘水体的微生物群落，不仅在水体物质与能量循环中具有重要作用，而且对养殖生物的健康存在直接或间接的影响(王鑫毅等, 2019)。深入研究水体微生物结构及功能，不仅可以了解微生物对养殖生物的影响，也可以利用微生物的特有性质和功能改善水质条件。目前，利用水体微生物某些特性，对水中污染物进行转移、转化及降解等一系列生物处理方法和技术，已得到广泛的认可和利用(付战勇等, 2019)。

刺参作为海洋生物，水体环境是其生存生长的主要场所，也是刺参病原菌来源的主要途径(孙静等,2019)。近年来，关于刺参养殖池塘水体菌群的研究工作越来越受到研究者关注。Gao 等(2010)在研究刺参养殖池塘水体菌群结构时发现，变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)等是池塘水体中主要优势菌，相对丰度为69.01%～97.21%。窦研等(2016)对普兰店、庄河、旅顺不同地区刺参养殖池塘水体菌群结构特征研究结果显示，所调查区域水体优势菌门均为变形菌门和拟杆菌门。关晓燕等(2010)对辽宁普兰店高温季节刺参养殖水体菌群结构特征的研究表明，6～9 月水体细菌数量不断上升，且优势菌主要隶属于变形菌门。

目前，已有的研究大多是基于形态学观察及纯培养等传统方法(冯振飞等, 2008; 高菲等, 2010; 李彬等, 2010)，具有一定的局限性，不能准确全面地反映养殖环境中微生物群落结构的真实情况。近年来，高通量测序技术结合生物信息学方法，为全面解析菌群结构和功能特征开启新途径(温崇庆等, 2016; 刘开辉等, 2017; 肖汉玉等, 2019; 来守超等, 2020)。

本研究选取辽宁长海刺参养殖池塘作为研究对象，利用高通量测序技术，解析不同季节刺参养殖池塘水体菌群结构与功能特征，以期为刺参养殖池塘水体微生态调控提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采样选取的刺参养殖池塘仅养殖刺参单一品种，且全年不投喂微生态制剂。池塘面积约为0.1 km2，水深为2～3 m，水源来自近海海域，利用潮汐带来的潮差进水和排水。分别于2019 年3 月(春季)、6 月(夏季)、9 月(秋季)和12 月(冬季)，利用玻璃采水器采集辽宁长海(39°16′42″N，122°36′5″E)同一刺参养殖池塘上层(离水面30 cm 处)和下层(离池底30 cm 处)水样各4 L，低温条件下带回实验室。水样经0.8 μm 无菌滤膜抽滤后，测定水质指标；再经0.22 μm 醋酸纤维素滤膜抽滤，滤膜用于细菌总DNA 的提取。

1.2 环境因子的测定

采用HACH(HQd)水质分析器，现场测定盐度(S)、温度(T)、酸碱度(pH 值)、溶解氧(DO)、氧化还原电位(ORP)。总氮(TN)、总磷(TP)、氨氮(-N)、硝酸盐(-N)、亚硝酸盐(-N)、磷酸盐(-P)等理化参数测定按照GB17378-2007 海洋监测规范进行。

1.3 DNA 提取

选用OMEGA Soil DNA 试剂盒提取刺参养殖池塘水体样品总DNA，使用NanoDrop 2000 超微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳检测所提取DNA 的浓度、纯度和完整性。

1.4 PCR 扩增与高通量测序

细菌16S rRNA 基因V3～V4片段的扩增引物为341F (5′-CCTACGGGNGGCWGCAG-3′)和806R (5′-G GACTACHVGGGTATCTAAT-3′)，应用Illumina MiSeq测序平台完成序列测序。

1.5 数据分析

采用 Usearch 软件，以 97%阈值开展 OTUs(Operational taxonomic units)操作分类单元聚类。采用RDPclassifier 软件以阈值0.8 进行物种分类操作，低于该阈值的分类结果划归为Unclassified 一类。利用Mothur 软件进行多样性分析。基于物种分类结果，得到在不同水平上各Rank 的丰度值，采用STAMP软件，比较样本或组间丰度差异，筛选条件为P＜0.05。

2 结果与分析

2.1 环境因子监测

辽宁长海刺参养殖池塘不同季节的水体环境因子监测结果见表1。根据中华人民共和国《海水水质标准(GB 3097-1997)》，所有采样点水质均符合国家Ⅰ类海水标准。从表1 可以看出，所监测水质指标均呈现显著性季节差异。其中，水体盐度在春季和冬季最高，夏季和秋季较低。从春季到冬季，水体溶解氧、总有机碳(TOC)、pH、硫化物和化学需氧量(COD)均表现出先降低后升高的趋势，TN、NO2--N、PO43--P和TN 表现出逐渐降低的趋势，氧化还原电位(ORP)、TP、NH4+-N 和NO3--N 则呈先升高后降低的趋势。

表1 不同季节刺参养殖池塘水体环境因子Tab.1 Environmental factors of water in A. japonicus culture pond in different seasons

2.2 高通量测序结果

不同季节刺参养殖池塘水体样品经检测得到原始序列40540～71190 条，其中，有效序列33663～67711条，聚类于372～835 个OTUs。测序覆盖率为95.94%～99.66%，表明测序结果真实反映样本信息(表2)。

2.3 菌群多样性

2.3.1 α 多样性 辽宁长海刺参养殖池塘水体菌群丰度和多样性均呈显著的季节性差异(表2)。根据菌群Chao 指数和ACE 指数可知，夏季水体菌群丰度最高，秋季水体菌群丰度最低，春季和冬季介于夏季和秋季之间。根据Shannon 和Simpson 指数可知，夏季水体菌群多样性最高，秋季水体菌群多样性最低，冬季略高于春季。

2.3.2 β 多样性 在OTU 水平上，基于加权Unifrac距离对所有样本进行三维坐标分析，结果见图1。其中，第1 主坐标(PCoA1)的贡献率为73.0%，第2 主坐标(PCoA2)的贡献率为14.0%，第3 主坐标(PCoA3)的贡献率为8.0%，三者累计贡献率为95.0%。不同组别样品分散于不同象限，表明池塘样品组间菌群结构具有显著差异。养殖池塘四季水体组内样品大多聚集在一起，即显示出较好的生物学重复。秋季水体菌群结构与其他3 个季节相比具有显著差异(P＜0.05)，春季和冬季水体菌群相似性最高。

表2 高通量测序结果Tab.2 High throughput sequencing results

图1 不同季节水体菌群Unifrac PCoA 图Fig.1 Unifrac PCoA of water bacterial community in different seasons

2.4 优势菌群结构特征

不同季节刺参养殖池塘水体菌群结构特征如图2所示。从门水平上看，不同季节刺参养殖池塘水体优势菌门主要隶属于变形菌门和拟杆菌门，二者相对丰度最高可达90%以上。其中，变形菌门在全年各季节均为第一优势菌门，相对丰度约占水体菌群的49.66%～70.02%。拟杆菌门均是不同季节的次优势菌门，春、夏、秋和冬的相对丰度分别为 27.35%、26.66%、23.33%和19.98%。

从属水平上看，春季刺参养殖池塘水体主要优势菌属为Planktomarina、Sulfitobacter、Litoreibacter、Loktanella、Amylibacter、Candidatus_Pelagibacter、Phaeocystidibacter、Olleya 和Polaribacter。夏季水体的主要优势菌属隶属于Planktomarina、Roseovarius、Litoreibacter、Candidatus_Pelagibacter 、 Vibrio 、 Halioglobus 、Phaeocystidibacter、Algibacter 和Pseudofulvibacter。秋季水体的主要优势菌属隶属于Pseudoalteromomas、Psychrobacter、Shewanella、Plaribacter、Olleya 和Bizionia。冬季水体的主要优势菌属隶属于Planktomarina、Sulfitobacter、Candidatus_Pelagibacter、Amylibacter和Polaribacter。优势菌属组成存在显著性季节差异(P＜0.05)。

2.5 差异菌群结构特征

属水平下的水体菌群相似性分析结果表明，不同季节的辽宁长海刺参养殖池塘水体菌群存在显著性差异。其中，秋季与其他季节相比，共有菌群种类较少，相似性较低(图3)。

LEfSe 分析结果显示(图4)，春、夏和冬季水体特异性菌门分别为疣微菌门(Verrucomicrobia)、放线菌门和厚壁菌门(Firmicutes)，秋季无特异性菌门。春季特异性菌属主要隶属于Planktomarina、Amylibacter和 Roseibacillus；夏季特异性菌属主要隶属于Owenweeksia、Phaeocystidibacter 和Euzebya；秋季特异性菌属隶属于Winogradskyella、Cryomorphaceae、Bizionia 和Psychrobacter；冬季特异性菌属主要隶属于Candidatus_Pelagibacter 和Sulfitobacter。

2.6 菌群功能特征

不同季节刺参养殖池塘水体菌群功能预测结果见图5。比对COGs 数据库25 种功能蛋白，水体菌群中24 种功能蛋白存在显著性差异(P＜0.05)。

春季和冬季水体菌群功能具有较高的相似性，表现为功能编码[C,E,F,G,H,I,Q,P,M,N,O,T,U,V,G,J,M]的17 种功能蛋白显著上调(P＜0.05)。其中，与代谢相关的全部功能均增强，具体表现在[C]能量的生产与转换，[E]氨基酸的运输和代谢，[F]核苷酸运输与代谢，[G]碳水化合物运输和代谢，[H]辅酶的运输和代谢，[I]脂质转运与代谢，[Q]次生代谢物的生物合成、运输和分解代谢，[P]无机离子运输与代谢方面。在细胞过程与信号传导方面，菌群功能的增强体现在[M]细胞壁/膜/包膜生物发生，[N]细胞的能动性，[O]翻译后修饰、蛋白质转换和伴侣蛋白，[T]信号传导机制，[U]细胞内运输、分泌和囊泡运输，[V]防御机制。在信息存储与处理方面，[K]转录与[L]复制、重组、修复相关功能蛋白显著增强。

与春季相比，夏季水体菌群功能编码[G,J,M]的功能蛋白显著下调(P＜0.05)。具体表现为[G]碳水化合物运输和代谢功能，[J]翻译、核糖体结构，[M]生物发生功能、细胞壁/膜/包膜生物相关功能的下降。

秋季水体菌群功能编码[D,Q,Z,W]的功能蛋白具有显著性差异(P＜0.05)。在细胞过程与信号方面，表现为[D]细胞周期控制、细胞分裂、染色体分裂，[Z]细胞骨架功能的下降，以及[W]细胞外结构相关功能的升高。在新陈代谢方面，具体表现为[Q]次生代谢物的生物合成、转运和分解代谢相关功能的下降。

3 讨论

微生物作为养殖池塘生态系统的重要组成部分，同时，作为生产者和分解者，保证了养殖池塘生态系统中物质循环与能量供给，对维持生态系统平衡具有至关重要的作用(李博, 2013)。本研究利用高通量测序技术通过对刺参养殖池塘水体微生物16S rRNA 基因V3～V4片段进行扩增测序，全面鉴定水体微生物种类特征，深入解析水体微生物组成情况，以期为养殖水体环境菌群调控和刺参养殖疾病防治提供一定的理论基础。

3.1 不同季节刺参养殖池塘水体优势菌群特征

图2 不同季节水体菌群组成的相对丰度Fig.2 Relative abundance of water bacterial community in different seasons

图3 属水平下水体菌群network 图Fig.3 Network diagram of water bacterial community in genus

本研究结果显示，辽宁长海刺参养殖池塘水体不同季节优势菌门均为变形菌门和拟杆菌门，二者相对丰度之和最高可达90%以上，该结果与李建光等(2014)的研究报道相吻合。变形菌群作为第一优势菌门，主要是因为其在原核生物分子生物学分类或表型分类中占据了绝对的优势(Gupta, 2000)。拟杆菌门作为次优势菌门，是海洋浮游细菌的重要组成部分，其菌属能够产生胞外水解酶来降解生物大分子(如几丁质、琼脂等)(施云芬等, 2017)，同时，拟杆菌门还能在发酵碳水化合物的同时有效分解纤维细胞壁的多糖，常常与脂质蛋白质等有机物的代谢转换有关，而这些有机物是水体碳循环的重要组成部分，在物质循环中具有重要作用(Chen et al, 2018)。

3.2 不同季节刺参养殖池塘水体差异菌群特征

比较不同季节的辽宁长海刺参养殖池塘水体差异菌群结构特征。结果显示，春、夏和冬季具有显著性差异的菌门分别隶属于疣微菌门(16.01%)、放线菌门(11.67%)和厚壁菌门(2.01%)；秋季相比于其他季节没有显著的特异性菌群。不同季节特异性菌群的相对丰度与水体的理化因子的相对含量有关，理化因子含量的改变对水体菌群的生长和分布丰度具有一定的影响。研究发现，水体理化因子为微生物生长和繁殖过程提供无机盐和有机物等营养物质，菌群结构特征往往受其所处环境中理化因子浓度的影响(张丽娜等,2012; Nishiyama et al, 2018)。疣微菌门中的微生物广泛存在于水生生态系统中，在生物地球的氮循环中起着重要作用(Bergen et al, 2014; Sharp et al, 2014; Shen et al, 2017)。本研究关于长海刺参养殖池塘不同季节水体所有监测环境因子显示，春季水体总氮含量在四季中最高。池塘生态系统为保持其稳定性，春季水体疣微菌门相对丰度的增加在加快水体氮循环过程中发挥重要作用。具有抗高温特性的放线菌门作为夏季的差异菌门，在养殖池塘水体中具有降解淀粉、蛋白等大分子的功能，可以产生抗菌类物质，并能形成耐热、耐干孢子等优点，有成为益生菌的潜力(王蓉等,2013)。本研究结果显示，环境温度越低，水体厚壁菌门细菌相对丰度越大。这是因为厚壁菌门下的芽孢杆菌纲大部分微生物，能够形成抗逆性极强的芽孢，从而具有极强的环境适应性(宋兆齐等, 2015)。此外，隶属于厚壁菌门的枯草芽孢杆菌(Bacillus su btilis)可以降低养殖水体中的硝酸盐和亚硝酸盐，能有效改善刺参养殖水体水质，提高机体消化酶和非特异性免疫酶活性，从而促进刺参生长(董春光等, 2015)，推测与冬季水体中检测出较低含量的硝酸盐和亚硝酸盐有关。

图4 不同季节水体菌群LEfSe 分析Fig.4 LEfSe analysis of water bacterial community in different seasons

图5 基于COG 数据库菌群功能注释Fig.5 The function of bacterial community prediction based on COG database

3.3 不同季节刺参养殖池塘水体菌群功能特征

通过比对COGs 数据库25 种功能蛋白，刺参养殖池塘水体菌群中24 种功能蛋白存在显著性季节差异。春季和冬季水体菌群功能具有较高的相似性，但春季主要体现在新陈代谢等相关功能蛋白显著增强(P＜0.05)；冬季主要表现在信息存储与处理、细胞过程与信号相关功能蛋白显著性增强(P＜0.05)。闫法军(2013)研究发现，水体菌群功能存在季节性差异与不同季节特异性菌群有关。本研究中，春季特异性菌门为疣微菌门，其参与水体氮循环，加速蛋白质代谢功能(Freitas et al, 2012)，进而促使蛋白翻译速度的增强，引起信息存储于处理相关功能蛋白上调。冬季特异性菌门为厚壁菌门，其中代表性梭菌纲作为一种专性厌氧菌，具有很强的降解能力和代谢活性(宋景华等, 2013)，一定程度上可以解释冬季水体菌群新陈代谢的增强。与春季和冬季相比，夏季的代谢、信息存储与处理、细胞过程与信号相关功能蛋白显著下降(P＜0.05)。放线菌门作为夏季的特异性菌群，产生的抗菌素种类与性质具有某些特性，能够抑制池塘水体中其他革兰氏阳性菌发挥功能(李文均等, 2002)，引起夏季水体菌群相关功能蛋白显著下降。同时，放线菌能产生生物活性显著的次生代谢产物，这种次生代谢产物是生命活动非必需的一类小分子有机化合物，这类有机化合物的增多，使生命活动必需的化合物相对含量降低(王淑霞等, 2007)，促使相关的功能蛋白显著下降。

4 结论

本研究通过高通量测序技术揭示了辽宁长海刺参养殖池塘不同季节水体菌群结构与功能的特征。研究发现，随着季节的变化，长海刺参养殖池塘水体菌群结构和功能具有显著演替过程。养殖池塘水体菌群丰度和多样性的最高季节是夏季，最低季节是秋季。同时，水体菌群结构的季节性演替与其功能之间存在一定的相关性，但二者之间的相互作用机制还有待于进一步的深入探究。