丁以绚 赵桂梅 李丽华 刘洋

1.云南省中医医院 昆明 650021 2.云南省第一人民医院 3.天津中医药大学第一附属医院医学实验中心

胃癌是一种起源于胃黏膜上皮的恶性肿瘤，是死亡率最高的癌症之一。目前，手术是胃癌最有效的治疗手段，晚期胃癌则需在手术基础上联合化疗、放疗及靶向药物治疗等常见的辅助治疗方案，但胃癌术后仍有较高的复发率与转移率，因此寻找抗癌效果较好的辅助治疗药物对晚期胃癌的治疗具有重要意义。随着中医药的发展与完善，中药复方治疗肿瘤得到了越来越多的肯定。近年研究认为，将中药复方应用于肿瘤的手术及化放疗过程中，对提高疗效具有一定的现实意义，尤其是对中晚期恶性肿瘤患者而言，有可能提高5%～15%的疗效[1-3]。

附子理中汤是由多味中药组成的中药复方，主要包含甘草、附子、人参、干姜和白术五种中药成分，其中甘草能补脾益气，附子可温脾阳、补肾阳心阳，人参能补元气，干姜可温中散寒，白术可燥湿利水、健脾益气[4]。研究表明，附子理中汤具有提高晚期胃癌患者免疫力、减轻放化疗所致的不良反应、降低患者体内幽门螺杆菌数量、缓解胃部疼痛、促进胃溃疡愈合以及提升患者生存质量等多种功效[5-8]。

目前有关中药复方治疗癌症的研究，多数为细胞或动物实验，往往因为中药成分的复杂性而影响研究结果的客观性与准确性[9]。因此，亟需探究新的理论与方法对中药复方预防或治疗癌症的效果进行研究。网络药理学主要利用生物大数据库分析药物与疾病之间的联系，是分析中药复方与疾病之间关系的有力工具[10]。因此，本文基于网络药理学方法对附子理中汤治疗晚期胃癌的靶点及作用机制进行探讨。

1 材料和方法

1.1 附子理中汤生物活性成分作用靶点筛选 通过药理学数据库、中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database，TCMSP）（http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php）对“附子、人参、干姜、甘草、白术”等中药所含活性成分进行检索，筛选条件设置为：类药性（drug likeness，DL）≥0.18，口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%[11]。筛选其中活性较高的化合物，以获取附子理中汤的潜在作用靶点。

1.2 晚期胃癌的相关靶点筛选 通过人类基因综合数据库（Human Gene Comprehensive Database，GeneCards）、人类孟德尔遗传在线（Online Mendelian Inheritance in Man，OMIM）数据库、遗传关联数据库（Genetic Association Database，GAD）对晚期胃癌的英文名称“advanced gastric cancer”进行检索，设定筛选标准为relevance score＞10，即可得到以上3个数据库中晚期胃癌的疾病靶点[12]。

1.3 韦恩分析寻找共同靶点 利用韦恩在线分析平台Draw Venn Diagram对GeneCards、OMIM和GAD数据库中晚期胃癌的疾病靶点进行进一步分析。将附子理中汤活性成分的靶点与晚期胃癌的疾病靶点进行映射，获取药物-疾病的共同靶点，这些靶点可能是附子理中汤治疗晚期胃癌的关键靶点。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络的构建 将上一步获得的药物-疾病共同靶点导入STRING10.5数据库，进行PPI分析。设定interaction score阈值为“0.900”，限定物种为Homo sapiens，运用Cytoscape 3.5.1软件，构建附子理中汤-靶点-疾病的PPI网络图[13-14]。

1.5 基因本体（gene ontology，GO）生物学功能分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路富集分析 利用生物学信息注释数据库DAVID在线分析网站（https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp），以P＜0.05作为筛选条件，得到药物-疾病相关交集靶点蛋白的GO生物学功能分析结果和KEGG通路富集分析结果。

1.6 分子对接 使用AutoDock 4.2软件对附子理中汤和药物-疾病共同靶点网络结果前10位的活性成分以及PPI网络排名前10位的核心靶点进行分子对接，使用分子可视化工具PyMol对其对接结果进行处理，利用打分函数Total-Score评价对接结果，设定Total-Score阈值为“6”[15]，筛选出结合活性较好的蛋白受体以及活性成分。

2 结果

2.1 附子理中汤活性成分与药物靶点筛选 从附子理中汤甘草、附子、干姜、人参、白术中分别筛选出不同种类的化学成分，去除重复后最终获得132种活性成分，列表上传到Pharm Mapper平台[16]，在返回的药物靶点中将非人源靶点及重复靶点剔除，最终得出潜在靶点蛋白共306个。见表1。

表1 附子理中汤活性成分数目与对应药物靶点数目Tab.1 The number of active ingredients of Fuzi Lizhong Decoction and the number of corresponding drug targets

2.2 不同数据库中胃癌的共同作用靶点筛选 通过GeneCards、OMIM、GAD三个数据库进行筛选，分别获取24 861、28 703、19 765个靶点，利用韦恩图取交集得到18 784个靶点。见图1。进一步分析胃癌相关靶点（18 784个）与附子理中汤化学成分相关靶点（306个）的相互交集，最终得出药物与疾病共同靶点287个。见图2。

图1 晚期胃癌交集靶点韦恩图Fig.1 Venn diagrams of the intersection targets of advanced gastric cancer

图2 附子理中汤药物与晚期胃癌交集靶点韦恩图Fig.2 Venn diagrams of the target of Fuzi Lizhong Decoction and advanced gastric cancer

2.3 PPI网络分析 PPI网络由36个节点和212条边构成，其中有18个靶点与其他靶点无交集。在该网络中，每条边代表靶点之间的靶向相互作用关系[17-18]。该网络中起主导作用的前10个靶点，包括表皮细胞生长因子（epidermal growth factor，EGF）、巨噬细胞移动抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）、微管相关蛋白轻链3A/B（microtubule-associated protein light chain 3A/B，LC3A/B）、重组人自体吞噬相关蛋白5（recombinant autophagy related protein 5，ATG5）、肿瘤相关蛋白53（tumor protein p53，p53）、蛋白激酶B（protein kinase B，PKB/AKT）、信号传导与转录激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3）、细胞周期素依赖性激酶抑制因子1A（cyclin dependent kinase inhibitor 1A，CDKN1A）、B细胞淋巴瘤-2样蛋白1（B-cell lymphoma-2 like 1，Bcl-2L1）。见图3。

图3 PPI网络图Fig.3 PPI network diagram

2.4 附子理中汤治疗晚期胃癌靶点的富集分析 进一步分析附子理中汤用于胃癌治疗的287个候选靶点的潜在机制，对候选靶点以DAVID在线软件进行GO生物学功能分析和KEGG通路富集分析。根据P＜0.05的条件，共获取980个GO条目，其中生物过程（biological process，BP）862个，细胞组分（cellular component，CC）29个，分子功能（molecular function，MF）89个。GO富集分析结果根据-logP值大小选取排名前10位的条目绘制。见图4。BP中主要包括细胞基质黏附、细胞代谢调节、基因正向表达，MF中主要包括DNA结合活性、核激素受体结合及L-乳酸脱氢酶活性等，CC中则主要包括细胞外空间、内质网膜、细胞器膜等。

图4 附子理中汤治疗晚期胃癌靶点的富集分析Fig.4 Enrichment analysis of Fuzi Lizhong Decoction in the treatment of advanced gastric cancer targets

对287个候选靶点参与的生物代谢途径KEGG通路进行分析，根据P＜0.05筛选出了65条附子理中汤治疗晚期胃癌的潜在信号通路。与GeneCards数据库检索到的胃癌晚期相关信号通路比对，得到56条附子理中汤-胃癌潜在通路。选择附子理中汤主要影响的20条生物途径进行图像绘制，KEGG结果提示附子理中汤治疗晚期胃癌的机制主要与p53信号通路（p53 signaling pathway）、2-氧羧酸代谢信号通路（2-Oxocarboxylic acid metabolism signaling pathway）和Wnt信号通路（Wnt signaling pathway）有关。见图5。

图5 附子理中汤治疗晚期胃癌靶点的KEGG富集通路Fig.5 KEGG enrichment pathway of Fuzi Lizhong Decoction in the treatment of advanced gastric cancer targets

2.5 分子对接 选取Cytoscape中相互作用的10个关键节点EGF、MIF、LC3A、LC3B、CDKN1A、ATG5、p53、AKT1、STAT3、BCL2L1，将蛋白分子及配体分子信息文件导入AutoDock Tools，通过运行AutoDock Vina进行对接，最后基于蛋白质数据库（Protein Data Bank，PDB）与SystemsDock网站数据库（SystemsDock Web Site Database，SWSD）进行受体与配体复合物的预测，获得分子对接相关信息。见表2。

表2 附子理中汤对晚期胃癌作用靶点分子对接结果Tab.2 Docking results of Fuzi Lizhong Decoction on target of advanced gastric cancer

在研究中，通常将Total-Score值=6作为阈值筛选结合活性较好的蛋白受体与活性成分，当对接分数越高时，表示结合活性越强。对接结果显示，p53、MIF、STAT3、CDKN1A、LC3B与化合物Sunitinib_CID_5329102对接分数均大于7.0，其中p53、MIF、STAT3与化合物对接分数均大于8.0，具有强烈的结合活性。化合物Sunitinib_CID_5329102的中文名称为舒尼替尼，分子式为C26H31FN4O6，是一种多靶点的生物靶向抗肿瘤药物，能同时抑制多条信号传导通路，具有抗肿瘤和抗血管生成作用，因此推测p53、MIF、STAT3在附子理中汤治疗晚期胃癌中起到关键性作用。

3 讨论

中医认为，胃癌是由于正气内虚、饮食不洁等诸多因素共同引起的疾病，而晚期胃癌多为胃部疾病缓慢发展而致[19-20]。附子理中汤历来是治疗胃疾的良方，相关研究指出，附子理中汤具有补脾益气、温中散寒、燥湿利水的效果，可改善消化吸收功能，促进糖和脂类代谢[21]。对于脾胃虚寒的胃癌患者，在化疗基础上联合附子理中汤辅助治疗，能够起到增强免疫力以及增效减毒的作用[22]。

本研究基于网络生物学与生物大数据库，共获取附子理中汤所含有的132种潜在化学活性成分及与活性成分密切相关的287个胃癌靶点，证实中药治疗疾病具有多成分、多靶点的特点。本研究中附子理中汤与胃癌相互作用的关键节点主要有EGF、MIF、LC3A、LC3B、CDKN1A、ATG5、p53、AKT1、STAT3、BCL-2L1等，主要信号通路分别是p53信号通路、2-氧羧酸代谢信号通路和Wnt信号通路。其中，p53信号通路在氧化应激、DNA损伤等多个应激信号的共同诱导下被激活，p53作为信号通路中的关键蛋白，可导致细胞周期停滞或细胞凋亡[23-25]。研究发现，胃癌晚期的重要特征之一就是细胞增殖失控，这表明调节细胞周期的分子机制与肿瘤发展具有密切联系[26-27]。另有研究表明，胃癌晚期患者预后与体内代谢途径失调相关[28]，附子理中汤可能通过2-氧羧酸代谢信号通路或p53信号通路调节晚期胃癌患者的细胞代谢情况。

除以上两条关系密切的信号通路外，KEGG通路富集分析中排名靠前的还有Wnt信号通路。Wnt蛋白家族是一个富含半胱氨酸的分泌型糖蛋白家族，Wnt信号通路的几个组成部分均与人类癌症的发生有关。在经典的Wnt信号通路中，Wnt配体主要通过抑制β-连环蛋白（β-catenin）降解复合体来稳定细胞质中的β-catenin水平[29-31]。本研究显示，附子理中汤中有效成分的靶点蛋白富集在Wnt信号通路，结果提示附子理中汤可能通过Wnt信号通路参与晚期胃癌的调控，Wnt信号通路可以作为晚期胃癌的治疗靶点。

MIF是在炎症反应和免疫介导疾病过程中具有关键作用的趋化因子。研究发现，MIF具有羟苯丙酮酸互变异构酶活性，还具有多巴色素互变异构酶活性，高表达的MIF能够抵消糖皮质激素的抗炎活性，能对细菌病原体的先天免疫应答起一定作用[32-33]。在癌症组织部位常常发生炎症浸润现象，而长期炎症积累是促进局部癌变的诱导因子。研究提示MIF在炎症部位高表达，可促进巨噬细胞在炎症局部的浸润、增殖及激活[33]。MIF一方面直接参与肿瘤细胞的调节，另一方面通过炎症反应、免疫反应及肿瘤微环境等间接参与肿瘤相关疾病的发展进程[34]。本研究提示MIF是附子理中汤与胃癌相互作用的关键节点之一，也可以作为晚期胃癌的治疗靶点。

STAT3表达水平与胃癌发生发展的相关性一直是临床研究的热点。相关研究表明，STAT家族中的STAT3在多种恶性肿瘤中发挥了致癌作用[35]，因此提高STAT3的表达可能是一种可行的干预治疗途径，但STAT3的过度表达则会加快胃癌细胞的增殖及转移[35-36]。本研究发现附子理中汤可能通过调节STAT3表达，对胃癌起到一定的治疗作用，但是针对STAT3表达丰度的影响还需进一步研究。

附子理中汤治疗晚期胃癌中具有多组分、多靶点、多途径调控等特点，本研究通过网络药理学分析，指明了附子理中汤治疗晚期胃癌的作用靶点，并通过模拟分子对接得出p53、MIF、STAT3是附子理中汤作用的关键节点，该结果为后续进一步的动物或细胞实验指明了方向。