浙江中医药大学附属第一医院 杭州 310006

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化转变的必经阶段[1]，其病理学基础是活化的肌成纤维样细胞（myofibroblastic-like cell，MFLC）增多，细胞外基质（extracellular matrix，ECM）大量沉积[2]。研究认为，肝星状细胞（hepatic stellate cell，HSC）的活化在肝纤维化过程中起着关键作用[2-3]。近年研究发现上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）可能是肝纤维化的另外一条重要机制[4]。通过EMT，具有上皮表型的静止期HSC、肝细胞、胆管上皮细胞以及窦状内皮细胞等可转化成为具有间质细胞表型的MFLC，并参与肝纤维化的发生发展[5]。多种信号通路参与肝内细胞EMT的分子调控，Hedgehog通路可以促进肝脏祖细胞、胆管上皮细胞等从上皮表型向间质表型转变，影响EMT的发生发展[6]，通过抑制Hedgehog信号通路阻断或逆转EMT可望成为肝纤维化治疗的新靶点。本研究拟观察四氯化碳（carbon tetrachloride，CCl4）诱导肝纤维化发生发展过程中Hedgehog信号通路及EMT的变化，以进一步加深对肝纤维化发病机制的理解，为肝纤维化的防治提供新的切入点。

1 材料和方法

1.1 实验动物 无特殊病原体（specific pathogen free，SPF）级雄性SD大鼠64只，7～8周龄，体质量（140±10）g，购于上海斯莱克实验动物有限公司[实验动物生产许可证号：SCXK（沪）2013-0016]，饲养于浙江中医药大学动物实验研究中心屏障环境[实验动物使用许可证号码：SYXK（浙）2013-0184]，明暗各12h，温度（25±1）℃，相对湿度60%～70%。所有大鼠均予普通颗粒饲料喂养，自由饮水，适应性饲养1周后开始正式实验。

1.2 主要试剂 CCl4购于上海凌峰化学试剂有限公司（批号：20140319）；谷丙转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、谷草转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）、总胆红素（total bilirubin，TBIL）检测试剂盒均购于上海申能-德赛诊断技术有限公司（批号：1412707020、14126070201、14104170202、14108170201）；羟脯氨酸（hydroxyproline，Hyp）检测试剂盒购于南京建成生物工程研究所（批号：A030-2）；TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit、PrimeScriptTMRT Master Mix、SYBR® Premix Ex TaqTMⅡ均购于宝生物工程（大连）有限公司（批号：AK1703、AI40832A、AK8902）；全蛋白提取试剂盒购于凯基生物技术有限公司（批号 ：KGP2100）；BCA Protein Assay Kit、Potent ECL Kit、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体、山羊抗小鼠二抗-辣根过氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）、山羊抗兔二抗-HRP均购于联科生物技术有限公司（批号：70-PQ0011、70-P1421、70-Mab5465、70-GAM007、70-GAR007）；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）兔抗体、平滑受体（smoothened，Smo）兔抗体购于美国Abcam公司（批号：GR212262、GR237368-1）；上皮-钙粘素（epithelial-cadherin，E-cadherin）（4A2） 小鼠抗体购于美国CST公司（批号：#14472）；神经胶质瘤相关癌基因同源蛋白-1（glioma-associated oncogene homolog-1，Gli-1）（H-300）兔抗体购于美国Santa Cruz公司（批号：G2313）。

1.3 实验仪器 日立7020全自动生化分析仪购于日立高新技术株式会社；ABI7900荧光定量PCR扩增仪为美国ABI公司产品；Varioskan Flash多功能酶标仪购于美国赛默飞公司；Alpha FCE化学成像系统购于美国Protein Simple公司。

1.4 分组及给药 大鼠适应性饲养1周后随机分为正常组和模型组，每组32只。模型组按3mL·kg-1的剂量皮下注射橄榄油稀释的40% CCl4，2次/周，首次加倍；正常组以等容量的橄榄油皮下注射，2次/周。

1.5 检测指标

1.5.1 肝功能指标检测 造模第2、7、21、42天两组各选择8只大鼠，空腹麻醉后腹腔静脉取血，分离血清，采用全自动生化仪检测血清ALT、AST、ALP、TBIL水平。具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.2 肝组织炎症和纤维化程度检测 分离肝脏，部分固定于10%中性甲醛溶液，常规苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色和Masson染色后，观察肝组织病理形态学改变，参照王泰龄等[7]制订的评分方案进行肝组织炎症和纤维化程度评分。

1.5.3 肝组织Hyp含量检测 分离肝脏，部分放置于-80℃保存备用。实验当天称取湿重40～50mg的肝组织放入玻璃试管中，加入水解液0.5mL，混匀。以保鲜膜封口并扎紧，针头刺一小孔后放入95℃水浴箱中20min，使肝组织充分水解。流水冷却后调节pH值为6.0～6.8，加双蒸水至5mL，混匀，取3mL稀释的水解液加入约15mg活性炭，混匀后3 500r·min-1离心10min，以碱水法检测肝组织Hyp含量，具体操作严格按照试剂盒说明书进行。

1.5.4 肝组织纤维化关键基因mRNA表达检测 以实时荧光定量聚合酶链式反应（quantitative Realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）检测肝脏α-SMA、E-cadherin、Smo、Gli-1的mRNA水平。所有引物均由宝生物工程（大连）有限公司设计并合成。见表1。采用10μL的PCR反应体系：2×SYBR5μL、10ng·μL-1的 cDNA模板2μL、10μmol·L-1上下游引物各0.4μL、2.2μL的ddH2O，以β-actin为内参进行扩增，以2-△△Ct法计算各目标基因的相对表达量。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.5.5 肝组织纤维化关键蛋白表达检测 提取肝组织总蛋白，蛋白定量后，每孔上样量50μg，行10%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）。电泳完毕进行湿转转膜，使用5%脱脂奶粉封闭，加入相应一抗4℃孵育过夜[α-SMA（稀释比例：1:1 000）、E-cadherin（稀释比例：1:1 000）、Smo（稀释比例：1:1 000）、Gli-1（稀释比例：1:200）、GAPDH（稀释比例：1:1 000）]。以含有Tween的Tris缓冲盐溶液（Tris buffer solution and Tween，TBST）洗膜后加入相应抗鼠或抗兔二抗（稀释比例：1:5 000），室温孵育1h。TBST洗膜后以化学发光法曝光，并分析灰度值，以目的蛋白灰度值/内参GAPDH灰度值代表目的蛋白的相对表达量。

1.6 统计学分析 采用SPSS 21.0统计软件进行统计学分析，计量资料以±s表示，行正态性检验，使用对数变换等方法将非正态分布资料转换成正态分布，组内不同时间点比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验。以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平比较 正常组大鼠血清ALT、AST、ALP、TBIL水平各时点间比较差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组大鼠血清上述指标表达水平随着造模时间的增加逐渐增高，21d时ALT水平较2d显著增高（P＜0.05），AST和TBIL水平较2d、7d均显著增高（P＜0.05，P＜0.01）； 在42d时上述各指标较2、7、21d均显著增高（P＜0.05，P＜0.01）。与正常组比较，2d时模型组上述各指标差异无统计学意义（P＞0.05）；7d时模型组AST、ALP、TBIL水平差异无统计意义（P＞0.05），ALT水平增高（P＜0.05）；21、42d各指标均较正常组同期显著增高（P＜0.05，P＜0.01）。见图1。

图1 两组大鼠肝功能指标比较Fig.1 Comparison of liver function index in each group

2.2 两组大鼠肝脏组织病理学变化 正常组大鼠肝组织结构基本正常，肝细胞呈条索状整齐排列，肝小叶形态完整，未见明显肝实质细胞病变，中央静脉和汇管区结构正常，胶原着色仅见于血管壁。模型组大鼠2d时肝脏汇管区有炎细胞浸润及个别小叶内坏死灶，少数肝细胞脂肪变；7d时汇管区炎症及小叶内坏死灶较2d时更明显，脂肪变性肝细胞增多，个别大鼠中央静脉周围及窦周隙少量纤维沉积；至21d炎症程度最明显，多只大鼠出现中央静脉周围及窦周少量纤维沉积；42d时模型组大鼠炎症活动度较21d下降，但纤维化程度明显加重，汇管区及坏死区纤维结缔组织增生，形成细小的条索，呈星芒状向肝小叶内延伸，形成宽窄不一纤维间隔。见图2。模型组各时点的炎症活动度评分均较正常组同期明显增高，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）；模型组各时点之间比较，21d时较2、7d显著增高（P＜0.01），42d与2d比较显著增高（P＜0.05）。模型组纤维化程度评分除2d外，其他3个时点均较正常组同期明显增高（P＜0.01）；模型组各时点之间比较，42d较2、7、21d显著增高（P＜0.01）。见图3。

图2 大鼠肝纤维化形成过程中肝组织病理动态变化Fig.2 Pathological dynamics of liver tissue during the formation of fibrosis in rats

图3 两组大鼠肝组织炎症活动、纤维化程度评分及Hyp含量比较Fig.3 Comparison of liver tissue inflammation activity，fibrosis degree score and Hyp content in each group

2.3 两组大鼠肝脏Hyp含量比较 正常组大鼠肝组织Hyp含量各时点间比较差异无统计学意义（P＞0.05），模型组大鼠肝组织Hyp含量随造模时间的增加而逐渐升高，其中42d时较2、7d显著增高（P＜0.05）。与正常组比较，模型组21、42dHyp含量较正常组同期显著增高（P＜0.01），2、7d与正常组同期比差异无统计学意义（P＞0.05）。见图3。

2.4 两组大鼠Hedgehog通路及EMT关键基因表达比较 qRT-PCR检测提示，正常组各时点肝脏E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1的mRNA表达差异无统计学意义（P＞0.05）。模型组大鼠肝脏E-cadherin的mRNA表达水平随造模时间的增加显著降低，其中21、42d较2、7d显著下降（P＜0.01）；而α-SMA、Smo、Gli-1的mRNA表达水平则随造模时间的增加而逐渐增高，其中α-SMA的mRNA表达水平在21d时较2d显著上调（P＜0.05），42d时较2、7、21d均显著 上调（P＜0.01），Smo、Gli-1的mRNA表达水平在42d时较2、7、21d均显著上调（P＜0.05，P＜0.01）。模型组2d时上述各指标与正常组同期比较差异无统计学意义（P＞0.05），7、21、42d大鼠肝脏E-cadherin的mRNA表达水平均较正常组同期显著降低（P＜0.05，P＜0.01），模型组21、42d大鼠肝脏α-SMA和Gli-1的mRNA表达水平较正常组同期均显著增高（P＜0.05，P＜0.01），42d大鼠肝脏Smo的mRNA表达水平较正常组同期均显著增高（P＜0.01）。见图4。

图4 两组大鼠肝脏E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1的mRNA表达比较Fig.4 Comparison of mRNA expression of E-cadherin，α-SMA，Smo and Gli-1 in each group

2.5 两组大鼠Hedgehog通路及EMT关键蛋白表达比较 Western blot检测提示，各时点正常组肝脏E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1的蛋白表达差异无统计学意义（P＞0.05）；模型组大鼠肝脏E-cadherin蛋白表达随造模时间的增加而逐渐下降，42d显著低于2、7、21d（P＜0.05，P＜0.01）；α-SMA、Smo、Gli-1蛋白表达随造模时间的增加显著增高，其中42d时α-SMA、Gli-1的蛋白表达水平显著高于2、7、21d（P＜0.01），21d时显著高于2、7d（P＜0.01），Smo的蛋白表达水平在21d和42d时均显著高于2、7d（P＜0.05，P＜0.01）。与正常组同期比较，模型组21d和42d时肝脏E-cadherin均降低，而α-SMA、Smo、Gli-1水平均增高（P＜0.05，P＜0.01）。见图5、6。

图5 大鼠肝脏E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1蛋白表达Fig.5 Protein expression of E-cadherin，α-SMA，Smo，Gli-1 in the liver of rats

图6 两组大鼠肝脏E-cadherin、α-SMA、Smo、Gli-1蛋白表达比较Fig.6 Comparison of protein expression of E-cadherin，α-SMA，Smo and Gli-1 in each group

3 讨论

肝纤维化是各种慢性肝损伤持续性组织修复的结果，其特征是MFLC产生和ECM的过度沉积。活化的HSC是MFLC的主要来源，而静止期HSC、肝细胞、胆管上皮细胞等也可通过EMT途径转化为MFLC，参与胶原的形成和沉积，该过程在肝纤维化的发生发展中起着至关重要的作用[2-5，8]。

上皮细胞失去其上皮表型特征，而逐渐获得间质细胞表型特征的过程即为EMT[9]，发生EMT的上皮细胞主要表现为上皮细胞分子标志如E-cadherin等的表达下降或丧失，以及一些间质细胞分子标志如α-SMA、波形蛋白等出现表达或表达增高[10-11]。研究报道，分离CCl4诱导的肝纤维化小鼠原代肝细胞，发现其波形蛋白、Ⅰ型胶原表达上调[12]。Sicklick等[13]研究发现原代培养小鼠的HSC可表达白蛋白、甲胎蛋白（alpha fetoprotein，AFP）、肝细胞核因子4α（hepatocyte nuclear factor 4α，HNF4α）等肝细胞功能基因，随着体外培养时间的延长，间质细胞标志物如α-SMA和Ⅰ型胶原表达逐渐上调，而肝细胞功能基因等表达明显下调。研究还发现，原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎患者的胆管上皮细胞也同时表达上皮及间质细胞标志如E-cadherin、波形蛋白等[14]。这些研究结果提示，在慢性肝损伤因素的刺激下，肝细胞、静止期HSC、胆管细胞可能发生EMT，转化为MFLC，该过程是肝纤维化发病机制中的重要环节[15]。本研究采用CCl4诱导大鼠肝纤维化模型，结果提示随着造模时间的增加，血清ALT、AST、ALP、TBIL水平以及肝组织匀浆Hyp含量逐渐增高，模型组2d时上述各项指标与正常组差异均无统计学意义，7d时ALT水平较正常组同期明显增高，21、42d时上述各项指标均较正常组同期显著增高。组织病理观察发现，模型组肝组织炎症活动度评分逐渐增高，21d达到最高值，42d有下降趋势，但仍维持在较高水平，各时点均较正常组同期明显增高；模型组肝组织纤维化程度评分也随造模时间的增加而增高，至42d达到最高值，除2d外其他3个时点均较正常组显著增高。研究同时发现，模型组大鼠E-cadherin mRNA和蛋白表达随造模时间的增加而逐渐下降，而α-SMA mRNA和蛋白表达则随造模时间的增加而逐渐上升，21、42d时均高于正常组同期，差异有统计学意义。以上结果提示，在肝纤维化的发生发展过程中，肝组织上皮细胞分子标志物表达逐渐下调，间质细胞分子标志物表达逐渐增加，存在着EMT的持续过程。

EMT受转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）、Hedgehog等多条信号通路调控[16-17]。Hedgehog信号通路由Hh配体和受体Patched（Ptc）、Smo组成的受体复合物及下游转录因子Gli家族（Gli1/2/3）等构成[18]。研究发现，当胆管结扎、CCl4等造成肝组织损伤后，静止期HSC、肝祖细胞、胆管上皮细胞的Hedgehog信号通路被激活，Hh产生增多，细胞中上皮细胞标志物的表达明显下调，而间质细胞标志物的表达逐渐增加，最终转化成为成熟的肌成纤维细胞[19-20]。研究证实，饮食诱导非酒精性脂肪性肝纤维化/肝硬化大鼠肝组织有Hedgehog信号通路的激活、Hh受体细胞的EMT等表现[21]。在HSC转化为MFLC后，使用Smo抑制剂Cyclopamine抑制Hedgehog信号，从而能够抑制间质细胞分子标记的基因表达，同时恢复上皮细胞分子标记的基因表达[20]。对纤维化大鼠模型和细胞模型的研究都发现阻断Hedgehog信号通路可以降低促纤维化细胞因子TGF-β1的表达，并能抑制ECM的沉积，抑制EMT进程；而激活Hedgehog信号传导途径则会促进EMT和肾小管间质纤维化[22]。这些研究结果表明，Hedgehog信号通路通过参与EMT影响纤维化进展，而各种肝损因素能够促使肝内HSC等上皮细胞活化，并激活Hedgehog信号传导途径，促使EMT沉积，最终导致肝纤维化。

综上所述，本研究结果提示，CCl4诱导能够成功建立肝纤维化大鼠模型，而且随造模时间的增加，肝组织损伤加重、肝纤维化进展，同时Hedgehog信号通路异常激活，Hedgehog信号通路可能通过介导EMT，从而促进肝纤维化进展。通过抑制Hedgehog信号通路阻断或逆转EMT，可为肝纤维化的治疗提供新的方向。