马玲 李海明 翟展艺 赵冲 李宁宁 年立全

肺癌是最常见的呼吸道恶性肿瘤，分为小细胞癌和非小细胞肺癌，非小细胞肺癌(NSCLC)占肺癌的85%[1-2]。尽管治疗NSCLC的临床试验有所进展，但结果仍然不尽人意，患者的5年存活率仅有15%[3]。远处转移被认为是导致NSCLC治疗失败的重要因素之一，研究涉及NSCLC转移的关键分子，对于新型有效的抗NSCLC治疗至关重要[4]。miRNA是一类短的非编码RNA，是基因表达的调节剂，通过结合靶基因的mRNA 3′-非翻译区(3′-UTR)影响多种生物学功能。许多研究显示，miRNA参与肿瘤进展，例如增殖、侵袭和细胞凋亡。MiR-141是miR-200家族中的一员，在多种肿瘤中表达上调包括食管癌的鳞状细胞癌、前列腺癌和乳腺癌[5-7]。KLF9是SP/KLF家族中的转录因子，通过与启动子上的GC盒元件结合来调节基因表达，在多种肿瘤中异常表达并对肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭有一定影响[8-9]。生物信息学软件分析预测，KLF9基因的3′UTR处可能存在miR-141结合位点，这表明miR-141与KLF9之间存在密切的关系。因此，本文我们研究miR-141与KLF9在NSCLC中的表达水平，二者之间存在的关系，及对NSCLC细胞增殖和侵袭的影响，对NSCLC的靶向治疗提供一定理论依据。

资料与方法

一、 研究对象

收集2017年5月-2019年5月在我院接受手术治疗的62例NSCLC患者，男性45例，女性17例，年龄(56.9±9.2)岁。患者术前均为未接受化疗或其他的手术治疗，收集患者的肿瘤组织及癌旁组织(距离肿瘤组织≥5cm)。排除合并其他肿瘤、支气管炎、支气管哮喘、慢性阻塞性肺疾病等肺部相关疾病的患者。本研究经过医院伦理委员会批准，患者同意并签署知情同意书。

二、 实验材料

NSCLC细胞H160、H460、H1299及正常人支气管上皮细胞BEAS-2B均购于中国科学院上海细胞库；1640培养基、青霉素、链霉素、胎牛血清、0.25%胰酶-EDTA、结晶紫粉末、多聚甲醛、MTT粉末等购于北京鼎国有限公司；总RNA提取试剂盒、反转录试剂盒购于日本TaKaRa公司；对照质粒和KLF9质粒由北京华大基因合成；小室购于美国Corning公司。

三、 qRT-PCR实验

收集组织和细胞样品，根据试剂盒说明书提取组织和细胞中的总RNA，反转录为cDNA，按照SYBR Premix Ex Taq试剂盒说明进行实时定量PCR。以管家基因GAPDH的mRNA水平作为内参照。引物设计如下： miR-141上游引物序列5′-CACATCCACCTCCTCCACATC-3′,下游引物序列5′-AA TGCGGCCGCAACTCAATCAACATCACCAT-3′， KLF9引物序列5′-CTCGCTTCGGCAGCACATA TACT-3′,下游引物序列5′-ACGCTTCACGAATTTGCGT-3′ 。GAPDH上游引物序列5′-AGAAGGCTGGGG CTCATTTG -3′,下游引物序列5′-AGGGGCCATCCACAG TCTTC-3′。采用ΔΔCt法计算mRNA相对表达水平。

四、 双荧光素酶报告基因实验

以健康人DNA为模板，PCR扩增miR-141与KLF9结合区域WT-3′-UTR和KLF9-MUT-3′-UTR的DNA片段，将PCR产物分别与pMIR-REPORT luciferase报告载体分别用SpeⅠ和 Hind Ⅲ双酶切后纯化、连接、转化、鉴定，获得KLF9的含WT-3′-UTR以及MUT-3′-UTR萤光素酶报告质粒。将其分别与miR-141 mimic共转染H160细胞48h，使用Pro-mega公司双萤光素酶活性检测试剂盒按说明书在单光子检测仪中检测细胞萤光素酶活性。相对荧光素酶活性=萤火虫荧光素酶活性值/海肾荧光素酶活性值(R/F)。

五、 细胞培养及转染

细胞均培养于含10%胎牛血清、100U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素1640培养基中，37℃、5% CO2条件下常规培养，待细胞密增生长到80%左右，用0.25%胰蛋白酶消化、传代，取对数生长期的细胞进行转染实验。H160细胞以104个/孔的密度接种于6孔细胞板，常规培养24h，细胞融合度约为70%时，将对数生长期的细胞随机分为对照组(转染对照质粒)、KLF9组(转染KLF9质粒)，按照脂质体lipofeetamine 2000说明书步骤操作，转染6h后，更换新鲜培养基，继续培养48h，收集各组细胞，qRT-PCR检测转染效果。

六、 MTT实验

对照组和KLF9组细胞以每孔2×103的密度接种于96孔板中，接种后每12h检测一次，每个检测时间点设置6个平行孔，20μL MTT溶液加入检测孔中，放置恒温箱中继续孵育4h。然后去除上清，每孔加入150μL二甲基亚砜溶液，震荡5min使细胞充分裂解，然后用酶标仪检测570nm处的吸光度值(OD)，OD值与活细胞的数量成正比。

七、 细胞侵袭实验

对照组和KLF9组细胞用无血清培养基悬浮，以每孔5×103的密度接种于小室中，培养孔中加入500 μL含10%胎牛血清的培养基，放置恒温箱中孵育48h。将小室取出放置多聚甲醛溶液中固定10min，然后置于0.1%结晶紫溶液中染色10min，用棉签轻轻擦掉小室里面为发生侵袭的细胞，放置显微镜下拍照。

八、 统计学分析

结 果

一、 miR-141和KLF9在NSCLC组织中的表达水平和相关性

miR-141在NSCLC组织中的表达水平为2.21±0.26，显著高于癌旁组织中miR-141的表达水平1.04±0.27，t=24.720，P<0.001。KLF9在NSCLC组织中的表达水平0.56±0.14，低于癌旁组织KLF9的表达水平1.21±0.23,t=19.418，P<0.001。NSCLC组织中miR-141和KLF9 mRNA相对表达水平呈负相关，r=-0.318,P=0.012(见图1)。

二、 miR-141靶向结合KLF9

荧光素酶报告实验结果表明，miR-141 mimic可减弱KLF9野生质粒荧光素酶活性，结合位点突变后，miR-141 mimic对KLF9突变质粒荧光素酶活性的抑制作用消失，miR-141可靶向结合KLF9(见图2)。

三、 KLF9在NSCLC细胞中的表达水平及转染实验

NSCLC细胞H460、H1650、H1299中KLF9 mRNA的相对表达水平低于人正常支气管上皮细胞(见图3A)。KLF9和对照质粒转染至H460细胞中经qRT-PCR检测到KLF9组KLF9 mRNA的表达水平高于对照组(见图3B)。

图1 miR-141和KLF9在NSCLC组织中的表达水平和相关性(A、B) ***表示NSCLC组与癌旁组织相比P<0.001

图2 miR-141靶向结合KLF9(A)miR-141可靶向结合KLF9(B)miR-141 mimic可减弱KLF9野生质粒荧光素酶活性 ***表示KLF9 WT+miR141 mimic与KLF9 WT组相比，t′=12.035，P<0.001.

图3 miR-141在在不同细胞中的表达水平

A:***表示H460、H1650、H1299与BEAS-2B细胞相比，t′=13.987、11.125、11.176，P均<0.001;B:***表示KLF9组与对照组相比，t=10.084，P<0.001.

四、 KLF9对H460细胞增殖和侵袭的影响

培养72h后KLF9组细胞OD值为0.80±0.07，显著低于对照组细胞OD值1.56±0.06(t=6.041，P<0.001)(见图4A)。细胞培养48h后KLF9组发生侵袭的细胞数为45.2±5.3，明显低于对照组发生侵袭的细胞数72.5±6.8(t=4.965，P=0.008)(见图4B)。

讨 论

NSCLC占所有肺癌的85%，在全世界癌症死亡率中位居第一，肿瘤细胞的侵袭和转移是造成患者5年生存率较低的主要原因之一，miRNA通过调节多种癌基因或抑癌基因在肿瘤转移中起关键作用[10]。miRNA参与多种生物过程包括细胞凋亡、增殖、侵袭、血管生成和DNA损伤修复等[11]。miR-141在鼻咽癌患者活检组织中的表达水平上调，影 响肿瘤发生发展的基因表达，可能为鼻咽癌患者的潜在生物标记物[12]。然而，miR-141在胃癌和胰腺癌中的表达水平降低，通过调节靶基因的表达影响肿瘤细胞的增殖和侵袭[13-14]。在本研究中，miR-141在NSCLC组织和细胞中的表达水平上调，通过调节蛋白KLF9的表达影响细胞的增殖和侵袭。

图4 KLF9对H460细胞增殖和侵袭的影响(×400)

KLFs是与DNA结合的转录调节因子，可控制细胞的基本生物过程，包括增殖、分化和迁移等。KLF6通过增加c-Jun降解抑制细胞信号传导来降低细胞增殖，从而在乳腺癌中起着抑癌作用[15]。KLF8作为肺腺癌的癌基因，与患者的不良预后相关[16]。KLF15同样报道在肺腺癌中表达异常，与患者的肿瘤分期相关，为患者预后的潜在标记物[17]。KLF11在乳腺癌中被甲基化，可能与其低表达和癌转移有关[18]。KLF9与基因启动子区域中的转录元件GC盒特异性结合，与多种癌症的发病机制有关，包括子宫内膜癌和其他女性生殖组织的内分泌反应性癌症[19]。在乳腺癌患者中KLF9 mRNA表达水平显著降低，参与细胞的迁移影响乳腺癌的发生和多种生长调节途径。在本研究中KLF9在NSCLC组织中的表达水平降低，其表达水平与miR-141的表达水平呈负相关，经过荧光素酶基因报告结果显示，miR-141可直接靶向结合KLF9。增加KLF9的表达水平后，NSCLC细胞的增殖和侵袭能力明显减弱。综上所述，miR-141可靶向结合KLF9，增加KLF9的表达可减弱NSCLC细胞的增殖和侵袭。另外降低miR-141的表达后，miR-141对KLF9的靶向作用减弱，可增加KLF9的表达水平，同样可抑制NSCLC细胞的增殖和侵袭，miR-141和KLF9均有望成为治疗NSCLC有效靶点。