吴建民，王建发，武 瑞

(黑龙江八一农垦大学 动物科技学院 黑龙江省牛病防治重点实验室，黑龙江 大庆 163319)

乳脂肪作为牛乳的重要营养物质及关键评价指标备受广大研究者关注。乳脂肪含有人体必需的矿物质以及脂溶性维生素。有研究证明，乳脂肪中丰富的共轭亚油酸(conjugated linoleic acid,CLA)对于下调人体胆固醇[1]与低密度脂蛋白含量[2]、抵抗动脉粥样硬化[3]等具有重要功效。奶酪作为牛乳进一步加工的产品在国际乳制品高端市场占有重要地位，而乳脂肪对于奶酪的风味具有重要影响，不仅因为合成乳脂肪的脂肪酸(fatty acid,FA)本身是风味物质，同时也是奶酪中甲基酮、仲醇、内酯、酯等风味物质的前体物[4]。因此，安全有效地提高牛乳中乳脂肪含量是加强我国乳业在国际市场上核心竞争力的必要手段之一。

消化道微生物与机体的生理代谢、免疫防御[5]、消化吸收[6]和行为方式等联系密切。在奶牛体内，瘤胃微生物参与众多生理作用，是保证其消化及能量循环有序进行的必要基础[7]。日粮中的营养物质首先通过瘤胃微生物的降解作用转化为可供奶牛机体利用的小分子物质，再进入各个系统发挥功能，对奶牛的生产性能具有显著影响[8]，其正常的生理状态更是保证奶牛机体稳态的重要前提[9]。近年来的研究热点主要集中在微生物影响宿主健康、调节宿主生理机能[10]等方面的潜在作用，而乳脂肪合成前体物的生成均受到瘤胃微生物的调节作用，其合成情况决定最终乳中脂肪含量的高低。因此，了解瘤胃微生物对乳脂肪合成前体物的生理功能、作用方式及影响因素，对提高牛乳中脂肪含量具有重要意义。

1 乳脂肪合成过程及影响因素

1.1 乳脂肪成分及乳脂肪酸合成途径乳脂肪在牛乳中含量为3%～5%，主要成分为甘油三酯(triglyceride,TG)，约占全部乳脂肪的98%，其余物质为二酰甘油(diacylglycero,DAG)、单酰甘油(monoacylglycerol,MAG)、磷脂(phospholipid,PL)、糖脂、胆固醇(cholesterol,CHO)、游离脂肪酸(free fatty acids,FFA)以及脂溶性维生素等。

乳脂肪由奶牛乳腺上皮细胞(dairy cow mammary epithelial cells,DCMECs)对脂肪酸加工而成。其合成所用的脂肪酸通常认为有两种来源：一种以瘤胃内微生物酵解日粮中碳水化合物而产生的挥发性脂肪酸为主要前体物质，再由DCMECs从头合成，包括中短链脂肪酸(C4～C14)和50%的C16脂肪酸，占牛乳中总脂肪酸的40%～45%。另一种以瘤胃内微生物分解日粮中脂肪而产生的脂肪酸为主要前体物质，进入血液循环流经乳腺组织时由DCMECs直接摄取利用，包括全部长链脂肪酸(C16以上)和余下50%的C16脂肪酸，占牛乳中总脂肪酸的55%～60%[11]；此外，奶牛体脂动员时血浆内与白蛋白结合的游离脂肪酸也可以经脂蛋白脂肪酶(lipoprotein lipase,LPL)水解后被DCMECs利用合成乳脂肪[12]，尤其当奶牛机体处于能量负平衡状态时，DCMECs主要利用经体脂动员而获得的长链脂肪酸合成乳脂肪。

1.2 影响乳脂肪合成的非自身代谢性因素乳脂肪含量是牛乳中最易产生浮动的指标之一，不同的饲养环境、管理方式、日粮结构，奶牛自身的健康状况，不同品种、胎次、泌乳时期、年龄等多种因素都可对最终牛乳中乳脂肪含量产生不同程度的影响。研究表明，在日粮中添加饱和脂肪酸对乳脂肪合成具有促进的作用；添加脂肪或油脂可以影响乳脂肪中脂肪酸的组成；在奶牛日粮中添加植物油，可以提高乳脂肪中反式脂肪酸的比例。另有研究发现，在高比例粗饲料的日粮中添加葵花子油时，乳中C18:0和C18:19显著提高[13]；当日粮中精粗比达到3∶2时，会引起乳脂肪合成下降[14]。当奶牛发生亚急性瘤胃酸中毒时，乳脂肪率一般下降到0.8%～1.0%；当环境温度超过30℃时，奶牛遭受热应激可引发乳脂肪合成下降。中国荷斯坦奶牛的正常乳脂肪含量为3.5%～3.7%，而牦牛的乳脂肪含量可达到7.5%以上。通常情况下随着奶牛生产胎次的增加，脂肪酸含量会逐渐降低[15]。

1.3 影响乳脂肪合成的自身代谢性因素奶牛日粮中碳水化合物经过瘤胃微生物作用转变为丙酮酸[16]，在瘤胃内进入不同的代谢途径转变为挥发性脂肪酸(volatile fatty acid,VFA)，约有80%的VFA被瘤胃壁和网胃壁吸收，剩余的VFA经消化道其他组织吸收后利用；日粮中脂类物质经过瘤胃微生物作用转变为非酯化脂肪酸(non-esterified fatty acids,NEFA)和VFA。

瘤胃微生物对日粮营养元素的酵解作用是乳脂肪合成的始动因素。进入血液循环后经由门静脉的VFA有60%～84%被肝脏吸收[17]，约有80%的丙酸用于糖异生，是奶牛合成葡萄糖的主要来源[18]，但进入肝脏的NEFA主要来源于体脂动员，这些NEFA可以经过β-氧化途径生成Acetyl-CoA，其中一部分进入柠檬酸循环氧化代谢，另一部分被氧化生成β-羟丁酸等酮体物质；或者被酯化生成TG后与载脂蛋白结合以极低密度脂蛋白(very low density lipoprotein,VLDL)形式[19]从肝脏转运入血。乳腺组织是前体物最终合成乳脂肪的场所，DCMECs将从头合成而来的脂肪酸或从血液中摄取的NEFA进一步去饱和化后，再将其合成TG。合成TG的过程在DCMECs的内质网上进行，脂肪酸以脂酰辅酶A的形式酯化在α-磷酸甘油上[20]。

2 瘤胃微生物的代谢调控作用

2.1 瘤胃微生物的种类瘤胃微生物被喻为奶牛自身的“隐形器官”，通常包括细菌(1010～1011cells/mL)、真菌(103～106cells/mL)和原虫(104～106cells/mL)[21]等。专性厌氧菌为瘤胃微生物主要成分，优势门水平细菌分别为厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和变形菌门(Proteobacteria)，共有超过7 400个种水平细菌[22]。不同年龄奶牛瘤胃内优势菌门均为厚壁菌门、拟杆菌门和变形菌门[23]。HENDERSON等[7]应用高通量测序技术对来自于世界各地的742头反刍动物瘤胃内容物进行检测发现，奶牛品种、地理分布和日粮结构等因素均对瘤胃微生物产生了一定的影响，但优势菌群大体相同；普雷沃菌属(Prevotella)、丁酸弧菌属(Butyrivibrio)和瘤胃球菌属(Ruminococcus)为属水平优势菌。

2.2 瘤胃微生物的代谢调控作用大多数瘤胃微生物编码碳水化合物降解酶或与碳水化合物降解相关的结合蛋白。依照作用底物不同，可以将瘤胃微生物分为纤维素降解类、淀粉降解类等。产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobactersuccinogenes)、白色瘤胃球菌(Ruminococcusalbus)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcusflavefaciens)、溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibriofibrisolvens)、溶纤维真杆菌(Eubacteriumcellulosolvens)、栖瘤胃普雷沃菌(Prevotellaruminicola)、反刍动物真杆菌(Eubacteriumruminantium)等为瘤胃微生物中主要的纤维素降解菌。其中革兰阴性菌的F.succinogenes与革兰阳性菌的R.albus和R.flavefaciens为瘤胃内相对丰度最高且纤维素降解能力最强的3个菌种。瘤胃中的真菌、原虫等也可以降解纤维素[24]。这些微生物将日粮中纤维素类物质逐步降解为单糖供机体利用。

嗜淀粉瘤胃杆菌属、栖瘤胃普雷沃菌属、牛链球菌属、溶淀粉琥珀酸单胞菌属、反刍兽新月形单胞菌属、溶纤维丁酸弧菌属、双歧杆菌属和梭菌属等细菌，内毛虫属和双毛虫属等原虫，以及瘤胃内部分厌氧真菌几乎全部可以产生α-淀粉酶，将淀粉水解为麦芽糖[25]后再进一步降解为单糖供机体利用。

瘤胃内微生物的组成结构亦会受到日粮中各营养物质比例的影响。奶牛日粮为高脂肪低纤维结构时，原虫和真菌的数量会出现降低的趋势，同时普雷沃菌属、琥珀酸丝状杆菌属的相对丰度会下调，而牛链球菌属会出现显著升高[26]。当奶牛日粮结构为高粗料日粮时，纤维杆菌门相对丰度会显著升高[27]。

3 瘤胃微生物对乳脂肪合成的影响

3.1 瘤胃微生物调节挥发性脂肪酸生成的机制瘤胃微生物通过自身合成的糖苷水解酶(glycoside hydrolases,GHs)以及碳水化合物结合模块(carbohydrate-binding modules,CBMs)等酶类将日粮中碳水化合物酵解为二糖或单糖形式，经过瘤胃内进一步代谢后以Acetyl-CoA为底物形式合成VFA(主要为乙酸和丁酸)，其中合成乙酸的途径主要有4种：乙酸磷酸转移酶-抑酸激酶(PTA-ACK)途径，Acetyl-CoA的硫酯键被磷酸乙酰转移酶(phosphotransacetylase,PTA,EC：2.3.1.8)磷酸化降解，生成乙酰磷酸，再被乙酸激酶(acetate kinase,ACK,EC：2.7.2.1)催化[28]，产生乙酸与ATP；乙酰辅酶A生成酶(ACS(ADP))途径，Acetyl-CoA经乙酰辅酶A生成酶[acetyl-CoA synthetase(ADP-forming),ACS(ADP),EC：6.2.1.13]作用后产生乙酸[28]；乙酸-琥珀酸辅酶A转移酶(ASCT)途径，Acetyl-CoA的辅酶A基团经乙酸-琥珀酸辅酶A转移酶(acetate-succinate CoA-transferase,ASCT,EC：2.8.3.18)作用转移给琥珀酸[27]而产生乙酸与琥珀酸辅酶A；乙酰辅酶A水解酶(ACH)途径，Acetyl-CoA的硫酯键被乙酰辅酶A水解酶/硫酯酶(acetyl-CoA hydrolase/thioesterases,ACH,EC：3.1.2.1)水解[28]，进而生成乙酸。此外，部分微生物还可以在瘤胃内厌氧条件下利用CO2为底物，通过Wood-Ljungdahl pathway途径[29]产生乙酸。

以Acetyl-CoA为底物合成丁酸的途径主要包括Acetyl-CoA向丁酰辅酶A(butyryl-CoA)转变的中心途径(central pathway)和butyryl-CoA向丁酸转变两个过程[30]，后者一般有3种途径：通过磷酸丁酰转移酶(phosphotransbutyrylase,PTB)和丁酸激酶(butyrate kinase,BK)产生丁酸，称为PTB-BK途径；在乙酸存在时通过辅酶A转移酶(acetate CoA-transferase)产生丁酸，称为BCACT途径；在乙酰乙酸盐存在时通过辅酶A转移酶(butyryl-CoA-acetoacetate CoA-transferase)产生丁酸[31]，称为BCAACT途径。

3.2 瘤胃微生物调节中长链脂肪酸生成的机制瘤胃微生物利用自身合成的脂解酶[25]水解日粮中脂类物质产生甘油、半乳糖和不饱和的NEFA，在进一步的氢化作用下，不饱和的NEFA被饱和，半乳糖和甘油转化为VFA，小部分NEFA和大部分VFA经瘤胃壁吸收入血。此外，一部分脂类以过瘤胃脂肪和菌体磷脂膜的形式到达十二指肠，经胰脂酶作用后转变为NEFA，进而被空肠吸收，再转化为低密度脂蛋白(low density lipoprotein,LDL)，经过淋巴管运输到达乳腺组织处。

不同种类的瘤胃微生物能够作用于不同的底物，其中黄色瘤胃球菌、白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌分泌纤维素降解酶的能力较强；嗜淀粉瘤胃杆菌和牛链球菌对淀粉降解的能力较强[32]；脂解厌氧弧杆菌降解脂类物质的能力较强[33]。瘤胃内的厌氧真菌以及原虫等微生物亦有不同程度的降解能力，但与瘤胃内脂类物质降解作用相关微生物的报道相对较少，有待研究人员的进一步阐明。

4 未来展望

综上可见，在不同日粮结构下的瘤胃微生物具有不同的特点。高脂肪日粮时会增加与脂类降解相关的微生物同时降低与碳水化合物类降解相关的琥珀酸丝状杆菌等微生物，而高纤维日粮时则会增加与碳水化合物类降解相关的微生物；而具备专一代谢功能的瘤胃微生物受到日粮结构的影响后其含量会发生变化，进而与之相关的代谢物产量会出现升高或降低，从而影响奶牛最终的生产性能指标。是否可以利用瘤胃微生物种间、群落间针对不同底物所表现出的优势物种情况以及瘤胃内环境与微生物的互作机制，通过人为干预，改变瘤胃中与乳脂肪合成前体物相关的微生物及其所编码的碳水化合物降解酶类和脂类物质降解酶类的含量与结构，进而提高最终牛乳中乳脂肪的含量，有待进一步的研究。明确这一问题对构建瘤胃微生物调节乳脂肪合成网络具有重要意义。