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生物力学作用对骨髓间充质干细胞增殖和成骨分化影响研究进展

2021-04-16曹盛楠师彬孙国栋王从安王丹丹

山东科学 2021年2期
关键词:剪切力成骨力学

曹盛楠,师彬,孙国栋,王从安,王丹丹*

(1.山东中医药大学 针炙推拿学院,山东 济南 250353;2.山东第一医科大学(山东省医学科学院)a.山东第一医科大学附属颈肩腰腿痛医院;b.山东省医药生物技术研究中心 山东省骨生物力学工程实验室,山东 济南 250012;3.山东第一医科大学第三附属医院,山东 济南 250062;4. 天津大学 医学工程与转化医学研究院,天津 300072)

骨髓间充质干细胞(boneless marrow mesenchymal stem cells, BMSCs)是一类具有自我增殖、多向分化潜能的干细胞,具备免疫源性低、方便取材、来源广泛等优点,常用于细胞组织移植、心血管疾病、骨缺损修复等多个领域[1-2]。研究认为BMSCs在生长过程中可感知不同的生物力学信号,从而影响细胞增殖、成骨分化等功能,而体内BMSCs的生长、成骨分化与骨组织的再生等也离不开复杂的力学作用环境[3-4]。目前已有相关力学对BMSCs影响的研究[5-6],但采用的力学加载模式、时间、频率等皆不尽相同,且不同的作用力对BMSCs增殖、分化的影响不同。本文阐述了不同生物力学(牵张力、压力、流体剪切力)对BMSCs增殖与成骨分化的影响,及其可能作用的基因和信号传导通路等,为BMSCs的骨组织工程与再生医学研究及更好地应用于临床治疗提供参考。

1 不同牵张力作用对BMSC增殖和成骨分化的影响

牵张力(mechanical tension stress,MTS)作为一个重要机械调节因素,对BMSCs起到拉伸应力作用[7]。目前国内外已有多种不同力学加载设备及力学刺激方式,其中研究较多的为牵张力。研究证实牵张力可有效促进细胞活性和功能,在骨再生和骨生物工程的临床应用中有重要指导意义[8]。但不同牵张力对BMSCs的增殖及成骨分化有不同的影响。

细胞的受力大小是无法测量出来的,只能间接通过硅胶膜的形变率、支撑物的上下运动位移来估计(根据牵拉头尺寸参数表计算, 文中力的强度用百分数来表示)。黎润光等[9]参考Schaffer建模方法自行建立体外细胞周期性机械牵张力学装置,在1.0 Hz的频率下,分别采用不同应力大小、不同时间的机械信号刺激,结果表明12%应力作用下增殖指数最高,可达到无应力状态下的1.86倍,而采用过强的牵张应力(18%)时,对细胞不具有促进增殖效应;同时,牵张力干预早期可以促进BMSCs增殖,干预时间超过48 h反而表现为抑制生长状态。井燕等[10]采用双轴力学应变系统选取0.4%、1.0 Hz频率、每天3次、每次2 h、间隔2 h的力学应变加载BMSCs,力学应变作用后细胞增殖指数(proliferation index, PI)比相应静态组增高,动物骨桥蛋白 ( Osteopontin, OPN) 和碱性磷酸酶 ( Alkaline phosphatase, ALP)的表达均有明显升高,表明力学应变可以提高BMSCs的增殖和成骨分化能力。戚孟春等[11]采用四点弯曲加力系统施加的40 min、0.2%机械牵张力作用于大鼠BMSCs,发现受力组在受力后细胞数明显高于对照组,BMSCs增殖活力显著增高并短暂性成骨向分化。通过加载机械张力,模拟骨组织受力情况发现,不同大小、时间、频率的机械张力均影响BMSCs增殖,大小适宜的机械张力可起到促进作用。

高莺等[12]同样采用四点弯曲加力系统对SD大鼠BMSCs施加0.2%机械牵张力,结果显示其细胞生长曲线与对照组相比差别不大,但骨钙素表达水平和ALP活性显著增高,且芯片杂交检测的差异表达基因数量变化明显。薛令法等[13]采用Flexcell体外细胞力学加载装置,施加0.5 Hz频率、0.8% 形变率、每天2次、每次30 min的间歇性牵张力,可促进小鼠BMSCs成骨分化。Wu等[14]通过Flexercell-5000给予人BMSCs机械拉伸(10%,0.5 Hz),数据显示LncRNA H19通过上调下游FAK来介导牵张力诱导的BMSCs成骨分化。Jang等[15]采用单轴拉伸应力单元系统,分别以3%和10% 拉伸力、0.26 Hz频率给予兔源BMSCs循环张力,结果发现张力促进BMSCs增殖增加,并且10%牵张力趋向平滑肌细胞分化,3%牵张力趋向成骨细胞分化。Song等[16]采用自行组装的机械拉伸装置以1 Hz频率、2%~8%拉伸15~60 min,经MTT检测后显示牵张力具有促进BMSCs增殖的重要作用,且采用8%应变、60 min拉伸处理的BMSCs细胞c-fos基因表达明显升高。通过以上研究发现,一定条件的周期性力学信号刺激可以促进BMSCs向成骨方向分化,但当拉伸幅度及作用时间不同时,可出现不同的细胞分化方向。

2 不同压力作用对BMSCs增殖和成骨分化的影响

力学刺激对细胞功能及组织发育、重建等有重要影响作用,BMSCs受到多种应力作用,而压应力同样作为正常人体关节运动中的主要受力因素,亦可引起细胞生物力学特性的变化[17],在研究中对BMSCs施以压应力(hydrostatic stress,HDS)能很好地模拟细胞的体内环境,同时又易于标准化和结果间的相互比较与分析[18]。

刘岩正等[19]采用自行设计的可控细胞液压加载装置给予BMSCs细胞相应的静压力刺激,结果表明采用90 kPa 静压力每天1 h 连续作用2 d促BMSCs增殖与成软骨向分化的作用最显著,PCNA、SOX-9、Aggrecan mRNA 的表达均显著升高。何川等[20]采用自制加压装置给予BMSCs加载静水压,发现40 kPa的静水压连续作用4 d可以促进Cbfa1、OC mRNA表达,连续作用7 d时仍对BMSCs表现为促成骨分化作用,在连续作用14 d时,作用转变为促成脂分化。李正章等[21]采用自行改制的细胞压力加载装置进行力学干预BMSCs,结果显示分别在5.32、10.64、21.28 kPa压力干预下细胞增殖指数均明显升高,MMP-2活性最低;而在29.26 kPa压力下增殖指数则明显下降且死亡增多,基质金属蛋白酶2(Matrix metalloproteinase-2,MMP-2)活性增高。潘景光等[22]采用自行设计制作的细胞液压加载装置对BMSCs经动态压力处理后,在0~45 kPa和0~90 kPa动态正压作用下,BMSCs增殖活性显著增强,且与压力值呈正相关。但通过透射电镜观察细胞的超微结构发现0~45 kPa动态压力作用下可促进细胞蛋白合成,而在0~90 kPa动态压力作用下,细胞中出现了凋亡小体,证实在该压力作用下可诱导细胞凋亡。赵永亮等[23]采用 Flexcell-5000基底压缩加载系统对BMSCs延迟性周期性压缩应力刺激(正弦波、0.5 Hz、20 kPa、2 h/d 压缩应力),结果显示应力可促进Col2的表达,抑制ROCK通路,并可能通过ROCK通路调控BMSCs成软骨分化。易飞舟等[24]采用自主研发的细胞液压加载装置,分别对BMSCs加载持续静压力45、90 kPa及周期性动压力0~45 kPa、0~90 kPa。数据显示90 kPa 静压作用下Sox9及Aggrecan基因的表达量显著高于0~90 kPa,而0~45 kPa压力促Sox9及Col2基因上调的作用则高于45 kPa压力,且在持续90 kPa的压力作用下BMCSs成软骨分化效果显著。当对BMSCs加载压力较小时,压应力可促进BMSCs增殖且向成骨方向分化,而当压力增大时BMSCs趋向成软骨方向分化。

3 不同的剪切力作用对BMSCs增殖和成骨分化的影响

骨骼组织中的细胞在生理状态下,需要一定强度的流体剪切应力(fluid shear stress, FSS)的刺激,使其保持正常的生理功能,同时,培养液的流动也可对所培养的细胞产生流体剪切应力[25],有研究表明,一定范围的流体剪切应力可以刺激BMSCs细胞的分化及增殖,保持细胞正常的生理功能[26-27]。

李洪鹏等[28]采用自制平行平板流动腔对BMSCs加载0.3 Pa的流体剪切力刺激30 min,结果表明流体剪切力可提高BMSCs细胞早期的细胞内ALP含量,细胞开始向成骨细胞分化,但未能促使晚期的骨钙素表达升高,说明此强度的流体剪切力不能成功促进人BMSCs最终实现向成骨方向分化。李立等[29]将BMSCs置于平行板流动腔内,以0.8 Pa切应力条件下诱导24 h,发现BMSCs可转化成内皮细胞。Kreke等[30]以0.16 Pa的流体剪切力作用于大鼠BMSCs细胞,在成骨诱导培养液(地塞米松、β-甘油磷酸和抗坏血酸)中培养,在第6、8、10和12 d检测时,流体剪切力促进了骨唾液酸蛋白(Bone sialoprotein,BSP)和骨桥蛋白(Osteopontin, OPN)的表达,促进了OPN蛋白的积累,抑制了脂蛋白脂肪酶(Lipoprotein lipase,LPL)的表达;在第20 d检测30 min的加载力下,OPN及BSP mRNA的表达水平达到最高,同时,持续120 min时成脂标志物脂蛋白脂肪酶的表达最少。刘立跃等[31]发现以0.42 Pa间歇性FSS 培养的BMSCs则向成骨细胞分化明显,而0.42 Pa持续性FSS和0.034 Pa的FSS对BMSCs没有明显的诱导分化作用。Stavenschi等[32]将BMSCs在封闭环境中分别给予不同剪切力,发现剪切力可以促进成骨标志物Cox2、Runx2 和OPN的mRNA表达上调,确定在BMSCs施加2 Hz、2 Pa、FSS时成骨标志物表达上调最明显。Huang等[33]发现适当的FSS单独处理可以使心肌细胞相关标记物的表达显著增加,诱导BMSCs向心肌细胞转化。由此可见,BMSCs的增殖和分化与流体剪切力的刺激有密不可分的联系,较低强度的流体剪切力对BMSCs的影响并不大,较高强度的流体剪切力会抑制细胞的成骨分化。

不同生物力学作用大小、频率、作用时间等对BMSCs增殖和成骨分化的影响,以及相关的作用基因,如表1所示。牵张力一般在24 h内,拉伸幅度为12%以下时,主要通过影响ALP、OPN、COLI、Ets1、Cbfa1、osterix、Runx2等基因,促进BMSCs增殖和成骨分化;压力范围在0~90 kPa,每日加压时间在1~6 h时,主要通过影响Cbfa1、OC促进BMSCs成骨分化;施加剪切力在0.3~2.0 Pa,加载范围在0.5~2.0 h时,主要通过ALP、OC、Runx2、OCN、COLIα等基因,促进BMSCs成骨分化。

表1 不同生物力学作用大小、频率、作用时间等对BMSCs增殖和分化的影响

4 生物力学作用影响BMSCs增殖和成骨分化参与调节的信号传导通路

细胞感受力学信号,通过信号传导通路,影响基因的表达和蛋白质的合成[34],机械刺激通过影响整合素表达,继而整合素将机械刺激转换为生物力学信号,实现对BMSCs的成骨分化调控。不同力学刺激BMSCs后,BMSCs的整合素α2β1、α5β1、αVβ3等表达量升高,同时以整合素为基础的FAK参与启动多条信号通路,通过调控不同的信号通路,进而促进与成骨分化相关基因表达。由此,多种细胞成分在信号传导中起到重要的作用,如细胞骨架、整合素、离子通道等方面参与机械力学信号转导[35]。

Simmons等[36]对人BMSCs施加0.25 Hz、3%形变率的牵张力,激活了细胞外信号调节激酶(ERK1/2)和P38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)通路,同时发现p38信号通路在BMSCs应变诱导成骨分化的调控中起抑制作用。刘小雅等[37]采用Flexcell细胞力学加载装置对小鼠BMSCs施加0.5 Hz、0.8%振幅的机械牵张力,结果表明在持续牵张力作用下可通过p38MAPK通路向成骨细胞分化。由此可见,小幅度的牵张力能通过p38MAPK信号通路促进BMSCs成骨分化。赵闯等[38]通过自行研制的细胞加载装置对BMSCs施加机械张应力0.25%、加力60 min,提示牵张力加载激活了Wnt信号3个关键分子Wnt3A、β-catenin与Lef-1,并刺激BMSCs增殖与骨向分化过程。另有研究者用Flexcell应变装置对大鼠BMSCs给予机械张应力10%、0.5 Hz频率,每日2次循环拉伸刺激,通过短干扰RNA下调Cbfa1基因表达后,成骨标记物表达出现下降,证明了牵张力刺激可能通过ERK1/2激活的Cbfa1信号通路促进大鼠BMSCs成骨分化[39]。同时,研究表明整合素-FAK信号通路参与了机械牵张诱导BMSCs成骨分化的调节,整合素介导的FAK活化后,Ras-Raf-MAPK/ERK、FAK-PI3K-Akt等信号通路可能进一步激活,调控细胞功能[40]。

杜静等[41]采用自主研发的静态液压加载装置对兔BMSCs加载120 kPa、每天1 h、连续4 d的力学刺激,结果显示压力刺激后,BMP2及Smad1/Smad5表达明显上调,同时促进 BMSCs软骨方向的分化。陈骥等[42]采用自行设计制作的可控细胞液压加载装置给予90 kPa压强加载1 h,提示压力可以通过激活RhoA的活性可促进DNA合成及细胞增殖,并在成骨诱导早期,依赖RhoA活性,压力可促进BMSCs成骨分化,而在成骨诱导晚期,RhoA活性抑制,OPN下调,压力对成骨分化晚期起抑制作用。另有研究者采用可控细胞液压加载装置对大鼠BMSCs施加90 kPa流体静压力,结果显示BMSCs中Sox9、Aggrecan及ColII的mRNA表达量增加,且Rac1在流体静压力导致的细胞成软骨分化过程中亦具有调控作用[43]。此外,静水压力还可通过Wnt-RhoA-ROCK调节BMSCs,进而影响早期成骨分化标志物基因的表达[44]。

研究者使用平行板培养箱研究剪切应力对人BMSCs成骨分化的调节能力,结果显示在1.2 Pa的流体剪切应力作用下,在一段时间内对Cbfa1/Runx2基因的表达有影响,而BMSCs的成骨活性迅速增强,I型胶原基因的表达下降,这些效应依赖于p38和ERK1/2的激活[45]。同时,Liu等[46]证实通过信号通路,间歇性流体剪切力可以诱导人BMSCs成骨分化。首先β1整合素感知细胞外间歇性FSS的刺激后,通过激活FAK活化ERK1/2导致Runx2磷酸化,磷酸化的Runx2启动成骨基因的转录,进而促进BMSCs向成骨细胞分化;其次,间歇性FSS激活的ERK1/2通过激活NF-κB增加BMPs的表达,BMPs的增加导致BMP/Smad通路的激活,最终导致Runx2的表达;再次,间歇性FSS激活的ERK1/2通过介导NF-κB的活化影响β1整合素的表达。

由此可见,不同生物力学作用影响BMSCs成骨分化的相关信号传导通路,如图1所示。牵张力作用下主要通过整合素表达,启动FAK-PI3K-Akt、Ras-Raf-MAPK/ERK等信号通路,压力作用BMSCs后激活Wnt-RhoA-ROCK等信号传导通路,流体剪切力作用后激活BMPs/Smad、FAK-ERK-NF-κB等信号通路,调节下游Runx2、ALP、OCN、OPN、COL等相关基因的作用,影响BMSCs的增殖和成骨分化。

5 研究展望

BMSCs是一类来源于中胚层的具有自我更新和多向分化潜能的干细胞[47]。由于其易于分离培养、体外增殖能力强、成骨分化特性较好,可作为骨组织工程的理想种子细胞[48],近几年研究者运用物理机械力学加载BMSCs,通过模拟细胞在体内微环境状态,研究其调节作用[49],结果表明各种物理性刺激均可影响BMSCs的生物学特性[50]。虽然实验方法与参数等设计各有不同,但仍可以得出一些共性点:适当的牵张力及流体剪切力对细胞产生的刺激不仅具有增殖效应,且大部分可使其向成骨方向分化;静压力加载于BMSCs时,细胞增殖活性也显著增强,对细胞产生的刺激大部分会使其向成软骨方向、成脂方向分化;在生物力学加载过程中,PI3K、AKT、Wnt、BMP/Smad、RhoA、ERK等信号传导通路对BMSCs的增殖、分化起着重要作用;但超过适当的强度刺激范围时,对BMSCs自身的分化会产生抑制作用。目前国内外学者不断模拟细胞所在力学微环境,促进了人们对力学微环境与BMSCs之间联系的了解,但也不能仅仅使用独立的因素研究机械因素和细胞之间的关系[51]。

此外,也仍有很多问题需进一步探索。例如如何进一步了解细胞感受机械信号传导的机制;BMSCs在发育、疾病、创伤修复中如何感知复杂机械环境刺激等。随着对BMSCs感受生物力学研究的深入,相信可以为BMSCs的组织工程与再生医学研究更好地应用于临床治疗等提供参考,为治疗应力性骨折和骨质疏松等疾病奠定理论基础。

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