赵钢艳，熊将军，刘灵芝，王明明，王 璨，易小明

湖南中医药高等专科学校附属第一医院/湖南省直中医院检验科,湖南株洲 412000

结直肠癌(CRC)是常见的消化系统恶性肿瘤，全球每年新发患者约110万例，死亡患者达88万例[1]。近年来，随着我国人民生活水平的提高，CRC的发病率有逐渐升高的趋势，严重威胁人民的身体健康[2]。深入研究CRC的病因及发生发展的机制，对临床诊断及治疗具有重要意义。长链非编码RNA(lncRNA)是长度约为200～300 bp的非编码RNA分子，发挥基因调控、分子支架的功能，广泛参与炎症、免疫及肿瘤等多种生理病理过程[3-4]。研究表明lncRNA在肿瘤中发挥重要作用[4]。FOXC2-AS1基因位于16q24.1，是一种能调控基因表达的lncRNA，参与细胞发育、分化及衰老等过程的调控[5]。研究表明，lncRNA FOXC2-AS1在非小细胞肺癌、骨肉瘤等肿瘤中存在表达异常的现象[6-7]，能够抑制抑癌基因P16的表达，促进恶性肿瘤的进展。Zeste基因增强子同源物2(EZH2)基因位于7q36.1，该基因编码的蛋白属于多梳蛋白复合物家族成员，参与细胞增殖、传代等，具有维持促增殖基因的持续转录状态的功能。RINKE等[8]报道，EZH2在肿瘤中发挥致癌基因的作用，如在白血病、乳腺癌等肿瘤中均能够促进肿瘤细胞增殖、浸润及转移等。此外，肿瘤中EZH2的表达升高还参与肿瘤化疗耐药性的形成，可能是新的肿瘤诊断及治疗靶点[9]。目前CRC中lncRNA FOXC2-AS1与EZH2相关的研究报道较少。本研究通过研究CRC组织中lncRNA FOXC2-AS1与EZH2的表达，探讨二者的临床意义。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2014年2月至2015年2月于本院诊治的86例CRC患者的临床病理资料。纳入标准：(1)CRC诊断均经病理学检查明确诊断；(2)初次诊治，患者以往无放化疗、靶向治疗病史；(3)临床病理及随访资料完整，患者无精神障碍性疾病。排除标准：(1)合并有溃疡性结肠炎、急慢性胃肠道炎症及自身免疫性疾病等。(2)有其他器官恶性肿瘤病史。(3)伴严重的心肺等脏器功能衰竭。86例CRC患者中男51例，女35例；年龄29～78岁，平均(51.5±7.2)岁；直肠癌31例，结肠癌55例；伴有淋巴结转移者24例，无淋巴结转移者62例；肿瘤最大径≤3 cm者60例，>3 cm者26例；肿瘤分期：Ⅰ期32例，Ⅱ期26例，Ⅲ期22例，Ⅳ期6例；病理分级：高中分化61例，低分化25例。本研究经患者及家属知情同意并已签署知情同意书，且经本院伦理委员会审核通过。

1.2方法

1.2.1实时荧光定量PCR检测lncRNA FOXC2-AS1及EZH2中mRNA表达 取术中黄豆粒大小的癌组织，以及距癌组织边缘3 cm以上的正常组织(经病理学检查明确诊断)作为癌旁组织，标本置于液氮中保存。取50 mg组织，应用Trizol法提取组织中总RNA，分光光度法鉴定RNA的浓度及纯度，吸光度(A)260/A280为1.8～2.1，无菌无酶水溶解后在-80 ℃条件下保存。以总RNA为模板，用TaqMan反转录试剂盒反转录合成cDNA。FOXC2-AS1正向引物序列为5′-CCT TCC TGG CTG TTC ATC GG-3′，反向引物序列为5′-TGG AAA TAA GTG GCA CGC CC-3′；EZH2正向引物序列为5′-ATC AGA GTA CAT GCG ACT GAG A-3′，反向引物序列为5′-GCT GTA TCC TTC GCT GTT TCC-3′；内参基因β-actin正向引物序列为5′-TTC CTT CCT GGG CAT GGA GTC-3′，反向引物序列为5′-TCT TCA TTG TGC TGG GTG CC-3′。反应体系20 μL，Master Mix 10 μL，正向及负向引物各1 μL，模板cDNA 2 μL，ddH2O 6 μL。反应条件为：94 ℃ 15 min，94 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，共38个循环。所有反应均在ABI7500实时荧光定量PCR仪上完成。采用相对循环阈值(Ct值)对数据进行分析，检测lncRNA FOXC2-AS1及EZH2 mRNA的相对表达水平，ΔCt = Ct待测基因-Ctβ-actin。

1.2.2免疫组化法检测EZH2蛋白表达 将癌组织及癌旁组织用中性甲醛固定24 h后，石蜡包埋切片，60 ℃烤箱中烤片3 h；二甲苯脱蜡2遍；梯度水化；微波炉法抗原热修复；3%过氧化氢去除内源性过氧化物酶0.5 h；5%羊血清封闭0.5 h；一抗4 ℃孵育过夜，EZH2一抗稀释比1∶500，抗体购自美国Abcam公司，货号ab227648；二抗孵育2 h；二氨基联苯胺显色2 min；苏木精复染30 s；梯度脱水，封片镜检。制备羊抗人Notch、Dll4多克隆抗体(工作浓度为1∶500)和即用型二抗(工作浓度为1∶2 000)；二氨基联苯胺显色，苏木精复染，光镜观察。采用二级计分法，结果以染色面积评分×染色强度评分表示，染色面积评分：<5%为0分，5%～25%为1分，>25%～50%为2分，>50%～75%为3分，>75%为4分；染色强度评分：淡黄色为1分，黄或深黄色为2分，褐色为3分。结果<2分判定为阴性，≥2分判定为阳性。

2 结 果

2.1癌组织与癌旁组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2 mRNA表达水平比较 癌组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2 mRNA相对表达水平均高于癌旁组织(t=29.837、19.736，均P<0.05)，见图1。

图1 癌组织与癌旁组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2 mRNA表达水平比较

2.2癌组织与癌旁组织中EZH2蛋白表达水平比较 癌组织EZH2蛋白主要表达于肿瘤细胞的细胞核，癌组织中EZH2蛋白表达阳性率为88.4%(76/86)，癌旁组织中EZH2蛋白表达阳性率为10.5%(9/86)，癌组织中EZH2蛋白表达阳性率高于癌旁组织(χ2=104.410，P<0.05)。见图2。

注：A为癌组织EZH2蛋白阳性表达；B为癌旁组织EZH2蛋白阳性表达。

2.3癌组织中lncRNA FOXC2-AS1与EZH2 mRNA表达的相关性 癌组织中lncRNA FOXC2-AS1与EZH2 mRNA表达水平呈正相关(r=0.611，P<0.05)。

2.4癌组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2蛋白表达与临床病理参数的关系 癌组织中lncRNA FOXC2-AS1蛋白表达水平及EZH2蛋白阳性表达与患者肿瘤TNM分期有关(P<0.05)，与患者的性别、年龄、肿瘤大小、肿瘤位置、肿瘤分化程度及是否伴淋巴结转移无关(P>0.05)。Ⅲ～Ⅳ期癌组织中lncRNA FOXC2-AS1蛋白表达水平、EZH2蛋白阳性表达明显高于Ⅰ～Ⅱ期癌组织(P<0.05)。

表1 癌组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2蛋白阳性表达与临床病理特征关系

续表1 癌组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2蛋白阳性表达与临床病理特征关系

2.5癌组织中不同lncRNA FOXC2-AS1、EZH2表达水平患者生存率比较 86例CRC患者中，死亡41例，存活45例，5年总体生存率为52.3%。lncRNA FOXC2-AS1高表达组44例，死亡30例，存活14例；lncRNA FOXC2-AS1低表达组42例，死亡11例，存活31例。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明lncRNA FOXC2-AS1高表达组患者5年总体生存率明显低于lncRNA FOXC2-AS1低表达组患者(P<0.05)。EZH2蛋白高表达组42例，死亡29例，存活13例；EZH2蛋白低表达组44例，死亡12例，存活32例。Kaplan-Meier生存曲线分析结果表明EZH2蛋白高表达组患者5年总体生存率低于EZH2蛋白低表达组患者(P<0.05)。见图3。

注：A为不同lncRNA FOXC2-AS1表达患者生存率比较；B为不同EZH2表达患者生存率比较。

3 讨 论

近年来随着我国人民饮食方式的改变及人口老龄化的加剧，CRC的发病率及病死率有逐渐升高的趋势。目前CRC的治疗主要包括手术治疗、放化疗、靶向药物治疗及免疫治疗等，部分早期患者获得良好的治疗效果，5年总体生存率达60%[10]。但晚期转移患者疗效不佳，即使经积极综合治疗后，患者的5年总体生存率低于10%。因此，有必要深入研究CRC发生发展的机制，寻找有效的早期诊断及药物治疗靶点。非编码RNA是近年来发现的细胞内不具有蛋白编码功能，但参与调控基因表达的小分子RNA，可分为lncRNA、微小RNA及环状RNA等。研究发现，lncRNA参与细胞发育、分化及凋亡等生物学调控过程，与感染、免疫及肿瘤等密切相关，有可能成为新的疾病诊断治疗的分子靶点[11]。

lncRNA lncRNA FOXC2-AS1是叉头盒蛋白C2(FOXC2)的反义RNA转录物，调控哺乳动物的发育及分化等过程[12]。近年来研究表明，lncRNA FOXC2-AS1在骨肉瘤[13]及肺癌[6]等肿瘤中表达上调，并能够作为一种致癌基因，抑制下游抑癌基因P15的表达，进而促进肿瘤细胞的恶性增殖及转移。本研究中，CRC癌组织中lncRNA FOXC2-AS1表达上调。但其表达上调的机制尚不清楚，可能与FOXC2-AS1转录后调控异常有关。有研究报道，miR-548c-5p能够结合于FOXC2-AS1 mRNA的3′非编码区，导致FOXC2-AS1 mRNA的稳定性下降，进而降低lncRNA FOXC2-AS1的表达水平，但在CRC中miR-548c-5p表达水平降低，结合FOXC2-AS1 mRNA的能力降低，从而促进lncRNA FOXC2-AS1表达[14-15]。此外，CRC癌组织中lncRNA FOXC2-AS1的表达水平与肿瘤分期有关，lncRNA FOXC2-AS1促进肿瘤的发生发展。PAN等[16]报道，lncRNA FOXC2-AS1表达水平升高可以促进CRC肿瘤细胞内Ca2+水平升高，激活蛋白酪氨酸激酶2(FAK)信号通路的传导，增强FOXC2 mRNA的稳定性，从而促进CRC增殖、迁移和侵袭。因此，lncRNA FOXC2-AS1有可能成为新的CRC潜在有效治疗靶点。本研究进一步分析癌组织中lncRNA FOXC2-AS1的表达与患者生存预后的关系，结果表明高表达lncRNA FOXC2-AS1的CRC患者5年总体生存率降低，表明lncRNA FOXC2-AS1的高表达可能导致患者的不良预后，检测癌组织中lncRNA FOXC2-AS1的表达有可能成为提示CRC患者预后的肿瘤标志物。

EZH2属于多梳蛋白家族成员，位于人类染色体7q36.1，参与调控早期胚胎发育、细胞分化及凋亡等生物学过程[17]。有研究报道，在舌鳞癌[18]、乳腺癌[19]等肿瘤中EZH2基因存在表达上调的现象，其能催化组蛋白H3赖氨酸27位的三甲基化，抑制下游抑癌基因P53等的表达，促进肿瘤细胞的恶性增殖及浸润、转移。本研究中，癌组织中EZH2 mRNA及蛋白的表达水平升高，可能与CRC中EZH2的转录调控异常有关。FENG等[20]研究表明，调控EZH2表达的转录因子E2F转录因子1(E2F1)表达水平升高，E2F1结合EZH2的基因启动子区，导致EZH2表达水平升高。本研究中，CRC中癌组织中EZH2的表达与肿瘤分期有关，表明CRC发生时EZH2促进肿瘤的发生发展。其机制可能是EZH2的表达水平升高激活Wnt信号通路，促进肿瘤细胞发生上皮间质转化。李妍等[21]发现，EZH2的表达上调能够抑制Wnt信号通路中β-连环蛋白的表达，促进N-钙黏素的表达，导致肿瘤细胞的浸润及转移能力增强。此外，本研究中高表达EZH2的患者生存预后较差，表明CRC癌组织中EZH2的表达可能有助于预测CRC患者的生存及预后。本研究进一步分析发现，CRC癌组织中lncRNA FOXC2-AS1与EZH2 mRNA表达水平呈正相关，目前二者之间的具体作用机制尚不清楚，但CHEN等[22]在前列腺癌体外细胞实验中发现，lncRNA FOXC2-AS1可作为分子海绵结合并抑制miR-1253的表达，进而促进miR-1253的下游靶基因EZH2的表达，在肿瘤细胞的增殖及恶性进展中发挥重要作用。

综上所述，CRC癌组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2表达水平升高，lncRNA FOXC2-AS1与EZH2 mRNA表达水平呈正相关，可能均参与了CRC的发生发展。癌组织中lncRNA FOXC2-AS1、EZH2的高表达与肿瘤分期及患者不良预后有关，二者有可能成为新的诊断及治疗CRC的分子标志物，但其具体的作用机制和临床意义需深入研究。