王晓玲，蔡国林，李卫青，初丽君，徐会茹，王珊珊，李 秋，杜祖波,*

1. 山东鲁花集团有限公司 (烟台 265200)2. 山东省花生油脂与蛋白精深加工技术重点实验室 (烟台 265200) 3. 江南大学粮食发酵工艺与技术国家工程实验室 (无锡 214122)

花生粕是花生仁压榨制油后的副产品，含有丰富的蛋白质，是我国蛋白质饲料原料市场的重要组成部分，2019年我国花生粕产量为411.6万t，预计2020年有望突破430万t。花生粕饲用价值较高，代谢能居于粕类饲料首位，粗蛋白质含量高达48%左右，功能特性与大豆蛋白相近，但相较于大豆蛋白更容易吸收，且肠胃胀气因子也很少[1]，作为幼龄动物生长发育必不可少的精氨酸，也是所有蛋白质饲料原料中含量最高的，可达5.2%。花生粕还含有丰富的黄酮类物质，总黄酮含量高达1.095 mg/g；其矿物质含量也比较丰富，含有K、Ca、Mg、Fe、Zn等多种元素。此外，花生粕中油脂类、鞣质、酚类、维生素、卵磷脂等营养物质含量也较为丰富[2]。但花生粕易感染黄曲霉菌，产生的黄曲霉毒素种类较多，其中含量最多、危害最大的是黄曲霉毒素B1[3](AFB1)。AFB1会对动物的肝脏造成伤害，并对其生长性能产生显著影响[4]。

目前去除黄曲霉毒素的方法主要有物理法、化学法和生物法。物理法、化学法主要采用吸附法、强氧化剂处理法等，易造成黄曲霉毒素去除不完全、产品营养损失等问题，限制了其在实际生产中的应用。生物法处理条件温和，同时还能提升花生粕营养价值及饲用品质，近年来备受关注。

本研究旨在通过筛选获得能高效降解黄曲霉毒素的菌株，并将其应用于工业生产中，通过降解花生粕中的黄曲霉毒素，提高产品的饲用安全性。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1主要原料、试剂

霉变花生粕，购自农贸市场；乳酸片球菌，江南大学提供；牛肉膏，蛋白胨，氢氧化钠及其他常规试剂，均购自中国国药集团化学试剂有限公司；AFB1标准品(纯度大于99%)、甲醇、乙腈(HPLC)，购自Sigma公司；25 mm、50 mm规格的0.22 μm微孔滤膜，购自上海兴亚净化材料厂。

1.1.2主要仪器、设备

超净工作台(SW-CJ-IFD)，苏州安泰空气技术有限公司；自动高压蒸汽灭菌器(GI54DWS)，致微(厦门)仪器有限公司；PCR基因扩增仪(TC-25/H)，杭州博日科技有限公司；凝胶电泳图像分析仪(JD-801)，江苏省捷达科技发展有限公司；高效液相色谱仪(U3000)，美国Dionex公司。

1.1.3培养基制备

(1)分离培养基

肉汤液体培养基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，葡萄糖10 g/L，pH 7.0，121 ℃灭菌20 min。

肉汤固体培养基：肉汤液体培养基中加琼脂2%，121 ℃灭菌20 min。

(2)筛选培养基

初筛培养基：KH2PO40.25 g/L，MgSO4·7H2O 0.25 g/L，KNO30.5 g/L，(NH4)2SO40.5 g/L，CaCl2·2H2O 0.005 g/L，FeCl3·6H2O 0.003 g/L，琼脂18 g/L，pH 7.0，121 ℃高压灭菌后加入4 μg/mL的AFB1，使其终浓度为20 ng/mL。 复筛培养基：肉汤培养基中加入4 μg/mL的AFB1，使其终浓度为20 ng/mL。

(3)其他培养基

发酵培养基：花生粕50 g，自来水50 mL，121 ℃灭菌20 min。

1.2 实验方法

1.2.1菌株的筛选

菌株初筛：称取50 g含有AFB1花生粕，装入250 mL的三角瓶中，加入无菌水使得料液比为1∶1，200 r/min 摇床震荡20 min，然后置于37 ℃恒温培养箱培养48 h。取少许花生粕溶于无菌水中，梯度稀释后涂布在初筛培养基上，挑取平板上全部菌落，甘油管保存。

菌株复筛：将初筛分离得到的菌株24 h一级活化，12 h二级活化。经二级活化后的菌株以10%的接种量接种到复筛培养基中，37 ℃、200 r/min震荡培养48 h。10 000 r/min离心发酵液并取上清，检测AFB1含量，比较不同初筛菌株发酵前后AFB1降解率，挑选降解率高的菌株做固态发酵筛选。

1.2.2菌株固态发酵

将经过复筛的菌株24 h一级活化，12 h二级活化，以10%的接种量接种至料液比为1∶1的花生粕中，并置于37 ℃恒温培养箱中发酵60 h，提取发酵花生粕中的AFB1，检测发酵前后AFB1的降解率，选取降解率最高的菌株作为目标菌株。

1.2.3菌株的鉴定

(1)对菌株进行形态学特征鉴定

观察菌落形态，并根据表型特征及生理生化特征进行分析。

(2)16S rDNA序列分析进行菌株鉴定

参照基因组试剂盒(细菌)说明书进行菌株基因组的提取，使用通用引物进行PCR扩增，并交由上海生工生物工程有限公司测序，将测序结果在NCBI上进行序列比对。并将比对后的数据进行基因系统进化树的构建和基因系统进化关系分析[5]。

1.2.4AFB1降解菌株在花生粕发酵酶解偶联工艺中的应用

花生粕经粉碎、灭菌(100 ℃、1 min)后，分别添加0.1%的纤维素酶和木聚糖酶，按5%接种量接种AFB1降解菌和乳酸片球菌，同时调节水分至45%±1%，输送至发酵床，发酵料层高50 cm，配备通气和加热装置，37 ℃好氧发酵60 h，发酵完成后输送至低温沸腾烘干机，经烘干、粉碎后，打包为成品。发酵酶解偶联工艺具体流程如图1所示。

图1 花生粕发酵酶解偶联工艺流程图

1.2.5AFB1含量的测定

AFB1含量的测定：参照《饲料中黄曲霉毒素B1的测定 高效液相色谱法》GB/T 36858—2018执行。

2 结果与讨论

2.1 菌株的筛选

观察培养基上菌落的生长情况，对平板上长势较好的12株菌落进行编号，分别为Y-1至Y-12，获得初筛菌株。

将初筛得到的12株菌株进行复筛，测定各菌株对AFB1的降解情况，结果见图2。从图中可以看出Y-2、Y-6、Y-7、Y-8、Y-12等5株菌株有较好的降解效果，可以作为候选菌株进行固态发酵实验。

图2 不同初筛菌株液态发酵对AFB1的降解作用

对复筛得到的5株菌株分别进行花生粕固态发酵。取发酵后花生粕烘干并粉碎，提取AFB1，测定各菌株对花生粕中AFB1的降解情况，结果如图3所示。

图3 不同复筛菌株固态发酵对AFB1的降解作用

从图中可以看出Y-6号菌株对花生粕的AFB1降解效果最明显，降解率达78.6%，明显高于其他菌株。

2.2 AFB1降解菌株的鉴定

2.2.1菌落及菌种的形态鉴定

Y-6号菌株在肉汤固体培养基上的菌落形状如图4a所示，菌落表面有褶皱，粗糙不透明，呈微黄色或灰白色。在肉汤液体培养基中培养时，会形成皱醭。将Y-6号菌株进行革兰氏染色后，呈紫色，经镜检菌体为椭圆形或柱状，见图4b；菌体周围伴有芽孢，见图4c。从Y-6号菌株形态特征可以初步判定其为芽孢杆菌属，但需要进一步的序列分析准确判定其类型。

图4 Y-6号菌株菌落形态及镜检图片

2.2.2菌种的分子鉴定

将Y-6号菌株的16S rDNA基因序列在NCBI(http:www.ncbi.nlm.nih.gov)上进行Blast比对分析，其基因系统进化树如图5所示。根据比对结果可以看出，Y-6号菌株与枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的同源性最高，达到99%，一般认为同源性大于98%就可以认为属于同一个种[6]。

图5 Y-6号菌株基因系统进化树

综上所述，根据形态特征并结合16S rDNA基因序列比对，确定该菌株为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis Y-6。

2.3 发酵酶解偶联工艺对AFB1含量的影响

通过添加Bacillus subtilis Y-6，利用微生物发酵结合复合酶制剂的生物偶联工艺处理花生粕，研究处理前后花生粕中AFB1含量的变化，如图6所示。

图6 处理前后花生粕中AFB1含量的变化

由图6可以看出，处理前后花生粕中AFB1含量变化明显。经计算，处理前其含量为142.6 μg/kg，处理后仅为8.1μg/kg，AFB1的去除率达到94.3%。直接经过固态发酵后花生粕中AFB1的降解率为78.6%，而经过偶联工艺后，花生粕中AFB1的降解率达到了94.3%，这是因为乳酸片球菌对AFB1有一定的吸附能力，进一步降低了AFB1的含量。国家饲料卫生标准(GB 13078—2001)规定花生粕中AFB1最高限量50 μg/kg，经过本方法处理后的花生粕AFB1含量仅为8.1 μg/kg，远低于国家50 μg/kg的限量要求，大大提高了花生粕在畜牧业的应用范围。

3 结论

本研究从污染AFB1严重的花生粕中筛选出一株能够高效降解AFB1的菌株，根据形态特征、16S rDNA序列比对鉴定目的菌株，确定其为枯草芽孢杆菌，命名为Bacillus subtilis Y-6。通过添加筛选出的枯草芽孢杆菌，利用微生物发酵结合复合酶制剂的生物偶联工艺处理花生粕，比较处理前后花生粕中AFB1含量的变化。研究表明，处理前AFB1含量为142.6 μg/kg，处理后仅为8.1 μg/kg，AFB1的去除率达到94.3%，远低于国家饲料卫生标准50 μg/kg的限量要求，大大提升了花生粕的饲用安全性。在生物发酵去除毒素的基础上，与生物偶联工艺结合，大大提升了花生粕的品质，不仅实现了蛋白质的体外预消化，而且增加了产品中有机酸、细菌素及各种酶类物质，增强了产品的功能性。本工艺发酵后可使花生粕每吨增值约1 000元，除去原辅料、能耗、人工等成本，每吨新增利润300元左右。但由于本研究所用AFB1降解菌为枯草芽孢杆菌，花生粕发酵后气味欠佳导致适口性较差，为加快本研究在工业化生产中的推广应用，下一步将深入研究改善发酵风味的工艺技术。