李超,焦静,孙萌萌,芦超,张永顺,田斌

结直肠癌的发病机制尚不明确,且部分患者预后较差,寻找治疗结直肠癌的新靶点及改善患者预后具有重要意义。长链非编码RNA(long non-coding RNA,Lnc RNA)是一类长度超过200个核苷酸的非编码RNA,可作为一种竞争性的内源性RNA与微小RNA(microRNA,miRNA)交互作用,共同参与肿瘤的发生发展[1]。Lnc RNA SNHG11是SNHG家族成员之一,在结直肠癌组织中表达升高,其高表达与结直肠癌淋巴结转移、远处转移、TNM分期等临床病理特征密切相关[2]。但目前,SNHG11对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响还未知。生物信息学软件预测显示,SNHG11与miR-154的核苷酸序列存在结合位点,提示SNHG11可能调控miR-154表达。miR-154在结直肠癌组织和细胞系中表达降低,过表达miR-154显著抑制结直肠癌细胞的增殖、集落形成、迁移和侵袭[3]。SNHG11可否通过调控miR-154表达影响结直肠癌细胞的生物学行为也还未知。本研究主要探讨了SNHG11对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响及其是否通过调控miR-154发挥作用,以期为结直肠癌的分子治疗提供靶点。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取50例2014年2月至2017年10月于焦作市人民医院接受手术治疗的结直肠癌患者的病理组织蜡块,检测癌组织及癌旁正常组织(距离癌组织>5 cm,病理检查未发现癌细胞),实时荧光定量PCR检测组织中SNHG11和miR-154的表达水平。50例患者中男36例,女14例;年龄36～78岁,平均(67.29±7.26)岁。术前均未接受辅助放化疗。23例高分化腺癌,17例中分化腺癌,10例低分化腺癌;肿瘤TNM分期:Ⅰ期15例,Ⅱ期17例,Ⅲ期11例,Ⅳ期7例;淋巴结转移21例,无淋巴结转移29例。排除合并心肾等重要脏器功能障碍、其他肿瘤、自身免疫疾病患者。本研究经医院伦理委员会批准同意,患者或家属自愿签署知情同意书。

1.2 材料及设备

结直肠癌SW1116细胞购自中国科学院上海细胞库;胎牛血清(FBS)、RPMI 1640培养基和二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒购自北京索莱宝公司;四甲基噻唑蓝(MTT)和胰蛋白酶购自美国Sigma公司;Trizol试剂、逆转录试剂盒和PCR试剂盒购自深圳晶美公司;PCR引物购自上海生工生物工程有限公司;LipofectamineTM2000试剂盒购自美国Invitrogen公司;SNHG11的小干扰RNA(si-SNHG11)及乱序无意义阴性序列(si-NC)、SNHG11过表达载体(pcDNA-SNHG11)及空载体(pcDNA)、miR-144-3p模拟物(mimics)及对照序列(miR-NC)、miR-154抑制剂(anti-miR-154)及阴性对照(anti-miR-NC)购自广州锐博生物技术公司;双荧光素酶活性检测试剂盒购自美国Promega公司;膜联蛋白V(Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)/碘化丙啶(PI)试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司;兔抗人细胞周期蛋白D1(CyclinD1)和P21多克隆抗体及羊抗人基质金属蛋白酶2(MMP-2)多克隆抗体购自武汉博士德生物技术有限公司;兔抗人B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2))和B淋巴细胞瘤-2相关蛋白(Bax)单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;兔抗人E-钙粘附素(E-cadherin)抗体购自美国abcam公司。SW-CJ-IFD超净工作台,苏州Aiptech安泰空气技术公司;CO-150型CO2培养箱,美国Thermo公司;DNM-9602全自动酶标分析仪,北京普朗医疗器械公司;FACS Calibur流式细胞仪,美国Becton Dickinson公司;GDS-8000凝胶成像分析系统,美国UVP公司;实时定量PCR仪,美国Thermo公司;DM2500P荧光显微镜,Leica公司;Olympus IX70显微镜,日本Olympus公司。

1.3 实验方法

1.3.1 细胞培养 SW1116细胞用含10 % FBS的 RPMI 1640培养基置于37 ℃、CO2体积分数5%的培养箱中培养。每隔2 d更换1次新鲜培养基。待细胞融合至80%～90%时,加入0.25%胰蛋白酶消化,进行传代培养。

1.3.2 细胞转染和分组 对数生长期的SW1116细胞接种于6孔板中,每孔1×105个细胞。待细胞融合至60%时,更换无FBS的培养基。参照LipofectamineTM2000试剂盒操作说明,分别转染si-SNHG11(si-SNHG11组)、si-NC(si-NC组)、pcDNA-SNHG11(pcDNA-SNHG11组)、pcDNA(pcDNA组)、miR-154 mimcs(miR-154组)、miR-NC(miR-NC组)、共转染si-SNHG11与anti-miR-154(si-SNHG11+anti-miR-154组)、si-SNHG11与anti-miR-NC(si-SNHG11+anti-miR-NC组)。转染6 h后更换新鲜培养基,继续培养至48 h,收集细胞qRT-PCR检测miR-154或SNHG11水平评价转染效果。

1.3.3 qRT-PCR检测SNHG11和miR-154表达水平 使用Trizol试剂提取细胞中的总RNA,微量核酸仪检测RNA的纯度和浓度。并逆转录为cDNA。以cDNA为模板,行PCR扩增。SNHG11正向引物5′-GTCCTCGGGAAAGAGACTGG-3′,反向引物5′-CAGCAAAGCCATCCAAGGGA;GAPDH正向引物5′-GAAGGTGAAGGTCGGAGT C-3′,反向引物5′-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3′;miR-154正向引物5′-CGCGAATTCGCATCTAG GACCTCCATCAC-3′,反向引物5′-ACGGGATCCGAACC ATCCCTTCA CTTACC-3′;U6正向引物5′-C TCGCTTCGGCAGCACA-3′,反向引物5′-AACGCTTCACGA ATTTGC GT-3′。PCR扩增条件:95 ℃5 min,95 ℃10 s,60 ℃30 s,72 ℃30 s,共35个循环。SNHG11以GAPDH为内参,miR-154以U6为内参,2-ΔΔCt法计算SNHG11和miR-154的相对表达水平。

1.3.4 MTT检测细胞增殖活性 转染后的各组SW1116细胞,以每孔1×103个细胞接种于96孔板中,每组细胞设置3个复孔。培养箱中分别培养24 h、48 h、72 h。培养结束后,每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml),继续孵育4 h。取出培养板,吸弃培养基,加入150 μl二甲基亚砜,结晶紫溶解后,振荡混匀,于酶标仪490 nm处测定光密度(OD)值。实验重复3次(n=9)。

1.3.5 流式细胞仪检测细胞凋亡 各组转染后的SW1116细胞,以每孔1×104个细胞接种于24孔板中,每组细胞设置3个复孔。培养箱中培养48 h后,胰酶消化,收集细胞。取1.0×106个细胞,加入适量PBS清洗2次。参照Annexin V-FITC/PI试剂盒操作说明,加入400 μl结合缓冲液,混悬细胞。加入10 μl Annexin V-FITC,混匀后,室温避光孵育10 min。再加入5 μl PI,室温避光孵育5 min。最后加入100 μl结合缓冲液,混匀后流式细胞仪检测。实验重复3次(n=9)。

1.3.6 Transwell检测细胞的迁移和侵袭能力 各组转染后的SW1116细胞,用不含FBS的RPMI 1640培养基调整浓度为5×104个/ml。细胞迁移实验:在Transwell上室中直接加入100 μl细胞悬液,下室加入500 μl含FBS的RPMI 1640培养基,每组细胞设置3个复孔。培养48 h后,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗后,0.4%结晶紫染色15 min。PBS清洗后后,倒置显微镜观察,随机选取5个视野,计数。细胞侵袭实验:首先在Transwell上室铺设基质胶,然后再加入100 μl细胞悬液,后续操作同细胞迁移实验。实验重复3次(n=9)。

1.3.7 双荧光素酶报告基因实验 验证SNHG11与miR-154靶向关系生物信息学软件预测显示,SNHG11与miR-154的核苷酸序列存在连续的结合位点。分别将SNHG11野生型质粒(SNHG11-WT)和突变型质粒(SNHG11-MUT)与miR-154 mimic(miR-154组)、miR-NC(miR-NC组)共转染至SW1116细胞。转染6 h后,更换培养基,继续培养至48 h后,收集细胞,检测荧光素酶活性,具体操作过程参照双荧光素酶活性检测试剂盒操作说明书。同时,分别转染si-SNHG11(si-SNHG11组)、si-NC(si-NC组)、pcDNA-SNHG11(pcDNA-SNHG11组)、pcDNA(pcDNA组)至细胞,转染6 h后,更换培养基,继续培养至48 h后,收集细胞,qRT-PCR检测细胞中miR-154表达水平,方法同1.3.3。

1.3.8 Western Blot法检测蛋白表达 使用RIPA裂解液提取细胞中总蛋白,并使用BCA试剂盒检测蛋白的浓度。以每孔30 μg蛋白进行十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳,每个蛋白样品设置3个复孔。电泳后,湿转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜,然后置于5%脱脂奶粉中进行封闭,时间1 h。分别加入Cyclin D1、Bcl-2、MMP-2、P21、Bax和E-cadherin 抗体,4 ℃孵育过夜。加入辣根过氧化酶标记的二抗IgG,室温孵育1 h。滴加化学发光试剂ELC,避光显影,凝胶成像系统曝光拍照。使用Image J软件分析条带灰度值。实验重复3次(n=9)。

1.4 统计学方法

2 结果

2.1 组织中的SNHG11和miR-154表达水平

癌旁组织和结直肠癌组织中SNHG11表达水平分别为(1.01±0.10)、(2.66±0.27),miR-154表达水平分别为(0.96±0.10)、(0.23±0.02)。与癌旁组织比较,结直肠癌组织中SNHG11表达水平显著升高(t=17.192,P<0.05),miR-154表达水平显著降低(t=21.475,P<0.05)。

2.2 抑制SNHG11表达对结直肠癌SW1116细胞增殖和凋亡的影响

与si-NC组比较,si-SNHG11组SNHG11水平显著降低(P<0.05),表明si-SNHG11转染成功,SW1116细胞中SNHG11表达受到抑制。如表1、表2和图1所示,与si-NC组比较,si-SNHG11组SW1116细胞活性降低,增殖相关蛋白Cyclin D1表达降低,P21表达升高,细胞凋亡率和促凋亡蛋白Bax表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,差异均具有统计学意义(P<0.05)。

表1 抑制SNHG11对SW1116细胞增殖和凋亡的影响

表2 抑制SNHG11对SW1116细胞中Cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

1A:抑制SNHG11表达对SW1116细胞凋亡的影响;1B:抑制SNHG11表达对SW1116细胞中Cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响图1 抑制SNHG11对SW1116细胞凋亡及增殖、凋亡相关蛋白表达的影响

2.3 抑制SNHG11对SW1116细胞迁移和侵袭的影响

如图2、表3和表4所示,与si-NC组比较,si-SNHG11组SW1116细胞迁移和侵袭细胞数、MMP-2蛋白表达水平显著降低(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。

2A:抑制SNHG11表达对SW1116细胞迁移和侵袭的影响;2B:抑制SNHG11表达对SW1116细胞中E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响图2 抑制SNHG11表达对SW1116细胞迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响

表3 抑制SNHG11对SW1116细胞迁移和侵袭的影响

表4 抑制SNHG11对SW1116细胞迁移和侵袭相关蛋白表达的影响

2.4 SNHG11靶向调控miR-154表达

如图3所示,生物信息学软件预测显示,SNHG11与miR-154的核苷酸序列存在结合位点。转染WT-SNHG11的miR-NC组、miR-154组细胞荧光素酶活性分别为(1.07±0.11),(0.39±0.04),两组比较差异有统计学意义(t=17.429,P<0.05)。转染MUT-SNHG11的miR-NC组、miR-154组细胞荧光素酶活性分别为(1.06±0.11)、(1.02±0.10),两组比较差异无统计学意义(t=0.807,P>0.05)。pcDNA3.1-SNHG11组细胞中miR-154表达水平为(0.36±0.04),显著低于pcDNA3.1组的(1.01±0.10)(P<0.05)。si-SNHG11组细胞中miR-154水平为(1.88±0.19),显著高与于si-NC组的(0.98±0.10)(P<0.05)。这说明SNHG11在结直肠癌SW1116细胞中靶向负调控miR-154表达。

图3 SNHG11核苷酸序列中与miR-154的结合位点

2.5 过表达miR-154对SW1116细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

miR-154组细胞中miR-154表达水平为(1.58±0.16),显著高于miR-NC组的(0.97±0.10)(t=9.699,P<0.05),表明miR-154 mimics转染成功,SW1116细胞中miR-154过表达。如图4、表5和表6所示,与miR-NC组比较,miR-154组SW1116细胞活性和增殖相关蛋白Cyclin D1表达降低,增殖相关蛋白P21表达升高,细胞凋亡率及促凋亡蛋白Bax表达升高,抗凋亡蛋白Bcl-2表达降低,迁移和侵袭细胞数及相关蛋白MMP-2表达降低,E-cadherin蛋白表达升高,差异均具有统计学意(P<0.05)。

表5 过表达miR-154对SW1116细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响

表6 过表达miR-154对SW1116细胞中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响

2.6 抑制miR-154能逆转抑制SNHG11对SW1116细胞增殖和凋亡的影响

如图5、表7和表8所示,与si-SNHG11+anti-miR-NC组比较,si-SNHG11+anti-miR-154组SW1116细胞活性、SNHG11基因水平、增殖相关蛋白Cyclin D1和抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平显著升高(P<0.05),miR-154基因水平、细胞凋亡率、增殖相关蛋白P21和促凋亡蛋白Bax表达水平显著降低(P<0.05)。

表7 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞增殖和凋亡的影响

表8 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞中Cyclin D1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表达的影响

2.7 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对细胞SW1116迁移和侵袭的影响

如表9、表10和图6所示,与si-SNHG11+anti-miR-NC组比较,si-SNHG11+anti-miR-154组SW1116细胞迁移和侵袭细胞数及相关蛋白MMP-2表达水平显著升高(P<0.05),E-cadherin蛋白表达水平显著降低(P<0.05)。

表9 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞迁移和侵袭数的影响

表10 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞迁移和侵袭相关蛋白E-cadherin和MMP-2表达的影响

3 讨论

细胞的异常增殖可诱发肿瘤,肿瘤的复发和转移是结直肠癌患者死亡的主要原因[4]。诱导肿瘤细胞的凋亡是肿瘤治疗的一种途径[5]。Lnc RNA具有广泛的基因表达调控作用,参与细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等行为,在肿瘤的发生发展中发挥重要作用[6-7]。研究Lnc RNA对结直肠癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响,有助于从分子水平了解结直肠癌的发病机制并为其治疗提供作用靶点。

4A:过表达miR-154对SW1116细胞凋亡率的影响;4B:过表达miR-154对SW1116细胞迁移和侵袭能力的影响;4C:过表达miR-154对SW1116细胞中Cyclin D1、P21、E-cadherin、MMP-2、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响图4 过表达miR-154对细胞SW1116增殖、凋亡、迁移和侵袭的影响

5A:抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞凋亡的影响;5B:抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞中Cyclin D1、P21、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响图5 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞凋亡及增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

6A：抑制miR-154能逆转抑制SNHG11对SW1116细胞迁移和侵袭的影响；6B：抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞中E-cadherin和MMP-2蛋白表达的影响图6 抑制miR-154逆转抑制SNHG11对SW1116细胞迁移、侵袭及相关蛋白表达的影响

SNHG11对肿瘤影响的研究还很少见。周改等[8]研究显示,结直肠癌患者血浆中SNHG11表达水平显著升高,可作为结直肠癌临床诊断和术后监测的潜在循环标志物,有助于早期发现癌前病变，降低结直肠癌的发病率。目前,SNHG11对结直肠癌细胞增殖、凋亡等生物信息学的影响还未知。本研究首先通过qRT-PCR检测了结直肠癌组织与对应癌旁组织中SNHG11表达水平,结果显示,SNHG11在结直肠癌组织中的表达水平显著高于癌旁组织,提示SNHG11可能参与结直肠癌的发生和发展。通过转染SNHG11的小干扰RNA抑制结直肠癌SW1116细胞中SNHG11表达,发现抑制SNHG11表达可抑制SW1116细胞增殖、迁移和侵袭,并促进细胞凋亡。CyclinD1和p21参与调控细胞的增殖,CyclinD1蛋白表达升高可促进细胞增殖,而p21蛋白表达升高抑制细胞增殖[9]。Bcl-2和Bax蛋白是与细胞凋亡密切相关的蛋白,Bcl-2抑制细胞凋亡,而Bax促进细胞凋亡[10]。肿瘤细胞的迁移和侵袭依赖于细胞外基质的降解,MMP-2可通过降解细胞外基质促进细胞的迁移和侵袭[11]。E-cadherin是上皮间质转化过程的标志性蛋白,其表达缺失或降低导致细胞间黏附降低,易于细胞脱落,从而发生迁移和侵袭[12]。本研究结果显示,抑制SNHG11表达可降低SW1116细胞中Cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表达,促进P21、Bax和E-cadherin蛋白表达,提示SNHG11可能通过调控与增殖、凋亡、迁移和侵袭相关蛋白的表达参与肿瘤发生发展。

Lnc RNA可通过调控miRNA的表达影响肿瘤的发生发展。为了进一步探讨SNHG11影响结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭的作用机制,本研究通过生物信息学软件预测显示,SNHG11与miR-154的核苷酸序列存在连续的结合位点,并通过双荧光素酶报告基因实验及qRT-PCR证实了SNHG11在结直肠癌SW1116细胞中靶向负调控miR-154表达。miR-154在胃癌、膀胱癌、乳腺癌等肿瘤组织或细胞系中表达降低[13-15],影响肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移和侵袭等生物学行为,与肿瘤的发生发展密切相关,是肿瘤治疗的潜在靶点。本研究结果显示,结直肠癌组织中miR-154表达降低,过表达miR-154可抑制结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭,并诱导细胞凋亡,与相关研究报道结果一致[16],说明miR-154在结直肠癌发生发展中起重要作用。本研究还显示,抑制miR-154表达可逆转SNHG11对结直肠癌细胞增殖、凋亡、迁移和侵袭及相关蛋白表达的影响,提示SNHG11通过靶向负调控miR-154表达影响结直肠癌细胞的恶性生物学行为。

综上所述,结直肠癌组织中SNHG11表达升高,miR-154表达降低;抑制SNHG11表达可有效降低结直肠癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力,促进细胞凋亡,其可能通过靶向负调控miR-154发挥作用。本研究存在一定的不足之处,只进行了体外细胞实验,接下来将通过动物实验探讨SNHG11对体内肿瘤生长的影响,以期为结直肠癌的治疗提供新途径。