刘 为，任佳俐，李信瑜，陈 琳，黄 帅

西南交通大学生命科学与工程学院，成都 610031

丽江乌头(AconitumforrestiiStapf)为毛茛科乌头属(AconitumL.)植物，分布于云南西北部及四川西南部，其性热-味辛-有毒，具有祛风除湿、温经止痛等药理作用；丽江地区民间常用于风湿病镇痛，全草杀虫[1，2]。乌头属植物主要药用成分为二萜生物碱，现代药理研究表明二萜生物碱具有镇痛、抗炎、杀虫、免疫调节和抗心律失常等药理活性[6]。从1981年开始陆续有学者对丽江乌头的化学成分进行研究，目前，从该植物中分离并鉴定出20余种二萜生物碱[1-5]，均为为高乌宁碱型C18-二萜生物碱和乌头碱型C19-二萜生物碱[7]。已经有学者报道过丽江乌头中二萜生物碱的镇痛、抗炎和免疫调节活性[8,9]，但对丽江乌头中二萜生物碱的强心活性却未见文献报道。有研究证明部分海替定型C20-二萜生物碱具有抗血小板聚集活性[10]；部分C18-二萜生物碱和乌头碱型C19-二萜生物碱有强心活性和心肌保护作用[11-13]；天然来源的化合物来源广泛、安全低毒，已经证实一些天然来源的化合物与抗肿瘤药物联用具有减毒增效的作用[14]。为了拓宽丽江乌头中的化合物成分类型，继续找寻具有药用价值的生物活性成分，本研究对采自云南丽江的丽江乌头中化学成分进行了进一步的研究。并测试了所有化合物对阿霉素诱导H9c2心肌细胞损伤的保护活性。

1 材料、仪器与试剂

1.1 材料

丽江乌头于2018年8月采自云南省丽江市，由云南中医药大学李国栋副教授鉴定，标本(NO.2018HS0801)保存于西南交通大学生命科学与工程学院。

1.2 仪器与试剂

核磁共振波谱仪(Bruker AV 400和600，TMS为内标，CDCl3为溶剂)；超高效液相色谱(ACQUITY UPLCI-Class)与四级杆飞行时间质谱(Xevo G2-S QTof)联用仪(Waters公司)；Hei-vap digital G3旋转蒸发仪(Heidolph公司)；薄层层析硅胶GF254(青岛海洋化工厂)；柱层析硅胶G和H(200～400目，青岛海洋化工厂)；碱性氧化铝(100～200目，天津致远化学试剂公司)；H9c2大鼠心肌细胞(上海研生生化试剂有限公司)；阿霉素、胰蛋白酶和甲基四唑蓝(MTT)(北京索莱宝生物科技有限公司)；显色剂为碘蒸气和改良碘化铋钾溶液，所用试剂均为分析纯。

2 实验方法

2.1 提取与分离

丽江乌头块根(11.8 kg)阴干后粉碎，95%乙醇室温下冷浸5次，每次3天。合并滤液，减压浓缩得乙醇浸膏。浸膏用水溶解，稀盐酸调节pH至2～3，用石油醚萃取，每次4 L，共4次，合并萃取液，浓缩得石油醚萃取物。然后用氨水溶液将水层的pH调至9～10，最后用二氯甲烷萃取，每次4 L，共4次，合并萃取液，浓缩得到生物总碱(140 g)。生物总碱经硅胶柱层析，以二氯甲烷∶甲醇(100∶1→0∶1)梯度洗脱，得到A～G七个部分，A部分经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺50∶1∶0.05→0∶1∶0.05)梯度洗脱得到A1(18 g)、A2(10.43 g)、A3(87.3 mg)、A4(1.62 g)和A5(18 g)五个部分。A1部分经硅胶柱层析(石油醚∶二乙胺100∶0.5→100∶2)，得化合物2(418 mg)和11(221 mg)。A2部分经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)，得化合物5(52 mg)。A3和A4部分经硅胶柱层析(石油醚∶二乙胺100∶0.6→1∶1)，得到化合物1(10 mg)、3(40 mg)、4(24 mg)、12(13 mg)和13(6 mg)。A5部分经硅胶柱层析(石油醚∶乙酸乙酯∶二乙胺10∶0.2∶0.1→1∶1∶0.5)，得到化合物9(14 mg)。E和F部分经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)，得到化合物15(1.88 g)、E3(1 g)和E4(600 mg)。E3部分经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.2→1∶1)得到化合物7(83 mg)。E4部分经硅胶柱层析(二氯甲烷∶甲醇10∶0.4→1∶1)得到化合物8(28.4 mg)。G部分经硅胶柱层析(石油醚∶二乙胺10∶0.2→1∶1)得到化合物6(817 mg)、10(40 mg)和14(17 mg)。

2.2 对阿霉素诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护作用

采用MTT法测定H9c2心肌细胞存活率[15]。取对数生长期的H9c2心肌细胞，0.25%胰蛋白酶消化后，接种于96孔板内，每孔100 μL，6×104个细胞，孵育24 h后分组，各组均设6个复孔。空白组加入无细胞的培养液；正常组加入正常的心肌细胞；模型组加入8 μmol/L的阿霉素处理细胞24 h；实验组加入浓度为40 μmol/L的待测化合物，同时加入8 μmol/L的阿霉素，培养24 h后，每孔加入5 g/L MTT溶液20 μL，4 h后吸除培养基，加入二甲基亚砜150 μL，摇床上振摇10 min，在492 nm波长处测定吸光值(A)，按照公式:细胞存活率=(实验组A值-空白组A值)/(正常对照组A值-空白组A值)×100% 计算细胞存活率。

图1 化合物1～14的化学结构Fig.1 The chemical structures of compounds 1-14

3 实验结果

3.1 化合物结构鉴定

图2 化合物1的1H-1H COSY(―)、HMBC(→)和NOESY()关键相关Fig.2 Key 1H-1H COSY (―),HMBC (→) and NOESY () correlations of compound 1

表1 化合物1的核磁数据(1H NMR：400 MHz；13C NMR：100 MHz，CDCl3)

续表1(Continued Tab.1)

化合物2无色油状液体；HR-ESI-MS：m/z448.563 1[M + H]+；分子式C26H41NO5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.75(3H，s，H-18)，1.04(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.11，3.25，3.31(各3H，s，3×OMe),2.01(3H，s，14-OAc)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:86.1(d，C-1)，27.1(t，C-2)，38.0(t，C-3)，34.5(s，C-4)，50.8(d，C-5)，24.6(t，C-6)，40.1(d，C-7)，78.0(s，C-8)，43.3(d，C-9)，45.3(d，C-10)，49.3(s，C-11)，29.2(t，C-12)，38.2(d，C-13)，76.0(d，C-14)，35.7(t，C-15)，83.5(d，C-16)，61.5(d，C-17)，26.6(q，C-18)，57.0(t，C-19)，49.4(t，C-21)，13.4(q，C-22)，56.4(q，1-OMe)，48.3(q，8-OMe)，56.4(q，16-OMe)，171.7(s，14-MeCO)，21.5(q，14-MeCO)。以上数据与文献[3]基本一致，故化合物2鉴定为14-acetoxy-8-O-methylsachaconitine。

化合物3白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z464.303 0[M + H]+；分子式C26H41NO6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.20、3.25、3.27(各3H，s，3×OMe)，2.03(3H，s，14-OAc)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：85.9(d，C-1)，26.3(t，C-2)，32.8(t，C-3)，38.7(s，C-4)，45.5(d，C-5)，25.1(t，C-6)，46.4(d，C-7)，73.8(s，C-8)，46.1(d，C-9)，45.1(d，C-10)，48.9(s，C-11)，28.6(t，C-12)，35.6(d，C-13)，77.1(d，C-14)，41.0(t，C-15)，81.7(d，C-16)，62.2(d，C-17)，79.7(t，C-18)，53.2(t，C-19)，49.5(t，C-21)，13.7(q，C-22)，56.3(q，1-OMe)，56.6(q，16-OMe)，59.6(q，18-OMe)，170.8(s，14-MeCO)，21.5(q，14-MeCO)。以上数据与文献[16]基本一致，故化合物3鉴定为14-acetyltalatizamine。

化合物4白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z422.290 1[M + H]+；分子式C24H39NO5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.02(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.21，3.26，3.31(各3H，s，3×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ:86.4(d，C-1)，25.9(t，C-2)，37.8(t，C-3)，34.6(s，C-4)，50.9(d，C-5)，24.8(t，C-6)，45.1(d，C-7)，72.9(s，C-8)，47.1(d，C-9)，46.0(d，C-10)，48.8(s，C-11)，27.8(t，C-12)，37.7(d，C-13)，75.7(d，C-14)，38.5(t，C-15)，82.4(d，C-16)，63.0(d，C-17)，79.6(t，C-18)，53.3(t，C-19)，49.6(t，C-21)，13.8(q，C-22)，56.4(q，1-OMe)，56.6(q，16-OMe)，59.6(q，8-OMe)。以上数据与文献[17]基本一致，故化合物4鉴定为talatisamine。

化合物5白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z452.308 7[M + H]+；分子式C25H41NO6。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.06(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.23，3.30，3.30，3.32(各3H，s，4×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：86.4(d，C-1)，26.1(t，C-2)，35.4(t，C-3)，39.6(s，C-4)，48.8(d，C-5)，82.5(d，C-6)，52.8(d，C-7)，72.7(s，C-8)，50.4(d，C-9)，45.8(d，C-10)，50.5(s，C-11)，28.5(t，C-12)，38.1(d，C-13)，75.7(d，C-14)，39.0(t，C-15)，82.2(d，C-16)，62.8(d，C-17)，80.9(t，C-18)，54.0(t，C-19)，49.5(t，C-21)，13.9(q，C-22)，56.6(q，1-OMe)，57.5(q，6-OMe)，56.3(q，16-OMe)，59.4(q，18-OMe)。以上数据与文献[18]基本一致，故化合物5鉴定为chasmanine。

化合物6白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z468.298 3[M + H]+；分子式C25H41NO7。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.07(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.23，3.30，3.30，3.32(各3H，s，4×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.2(d，C-1)，33.9(t，C-2)，72.2(d，C-3)，43.5(s，C-4)，48.6(d，C-5)，82.3(d，C-6)，52.4(d，C-7)，72.6(s，C-8)，48.9(d，C-9)，38.1(d，C-10)，50.2(s，C-11)，28.1(t，C-12)，45.3(d，C-13)，75.5(d，C-14)，39.1(t，C-15)，82.0(d，C-16)，62.2(d，C-17)，77.5(t，C-18)，47.4(t，C-19)，49.1(t，C-21)，13.7(q，C-22)，56.4(q，1-OMe)，57.3(q，6-OMe)，56.0 (q，16-OMe)，59.2(q，18-OMe)。以上数据与文献[19]基本一致，故化合物6鉴定为ezochasmanine。

化合物7白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z632.352 9[M + H]+；分子式C34H49NO10。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.09(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，2.98，3.23，3.26，3.29，3.52，3.85(各3H，s，6×OMe)，8.00(2H，d，J=8.9 Hz，H-2′/6′)，6.91(2H，d，J=8.9 Hz，H-3′/5′)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：83.2(d，C-1)，33.5(t，C-2)，71.9(d，C-3)，43.2(s，C-4)，48.2(d，C-5)，82.7(d，C-6)，48.7(d，C-7)，78.7(s，C-8)，46.1(d，C-9)，35.9(d，C-10)，50.8(s，C-11)，36.8(t，C-12)，75.4(s，C-13)，79.2(d，C-14)，41.6(t，C-15)，83.9(d，C-16)，61.2(d，C-17)，77.5 (t，C-18)，47.8(t，C-19)，48.8(t，C-21)，13.5(q，C-22)，56.0(q，1-OMe)，58.7(q，6-OMe)，58.8(q，8-OMe)，59.0(q，16-OMe)，59.2(q，18-OMe)，166.4(s，14-OCOAs)，123.2(s,C-1′)，131.9(d，C-2′/6′)，113.6(s，C-3′/5′)，163.3(s，C-4′)，55.5(q，4′-OMe)。以上数据与文献[20]基本一致，故化合物7鉴定为crassicautine。

化合物8白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z614.334 4[M + H]+；分子式C34H47NO9。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.16(3H，t，J=7.2 Hz，H-22)，3.27、3.37、3.94、3.95(各3H，s，4×OMe)，1.81(3H，s，14-OAc)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：72.3(d，C-1)，26.8(t，C-2)，29.8(t，C-3)，37.3(s，C-4)，41.5(d，C-5)，25.0(t，C-6)，43.5(d，C-7)，86.6(s，C-8)，41.5(d，C-9)，40.8(d，C-10)，49.1(s，C-11)，29.2(t，C-12)，39.3(d，C-13)，76.0(d，C-14)，38.6(t，C-15)，83.2(d，C-16)，63.4(d，C-17)，78.9(t，C-18)，56.6(t，C-19)，48.6(t，C-21)，13.0(q，C-22)，56.8(q，16-OMe)，59.5(q，18-OMe)，171.3(s，14-MeCO)，21.6(q，14-MeCO)，164.9(s，OCOVr)，123.6 (s， C-1′)，111.8(d，C-2′)，148.8(s，C-3′)，153.1(s，C-4′)，110.4(d，C-5′)，123.4 (d，C-6′)，56.1(q，3′-OMe)，56.1(q，4′-OMe)。以上数据与文献[21]基本一致，故化合物8鉴定为geniculatine C。

化合物9白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z408.273 8[M + H]+；分子式C23H37NO5。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.04(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.25、3.32(各3H，s，2×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：86.4(d，C-1)，25.9(t，C-2)，32.3(t，C-3)，39.2(s，C-4)，46.0(d，C-5)，24.7(t，C-6)，45.9(d，C-7)，73.1(s，C-8)，47.1(d，C-9)，37.7(d，C-10)，48.9(s，C-11)，27.8(t，C-12)，45.7(d，C-13)，75.7(d，C-14)，38.4(t，C-15)，82.3(d，C-16)，63.1(d，C-17)，68.9(t，C-18)，53.1(t，C-19)，49.6(t，C-21)，13.8(q，C-22)，56.6(q，1-OMe)，56.4(q，16-OMe)。以上数据与文献[22]基本一致，故化合物9鉴定为cammaconine。

化合物10无色棱晶(石油醚∶丙酮=10∶1)；HR-ESI-MS：m/z372.244 6[M + H]+；分子式C23H33NO3。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：0.74(3H，s，H-18)，1.03(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.25，3.34(各3H，s，2×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：80.1(d，C-1)，25.0(t，C-2)，38.1(t，C-3)，35.2(s，C-4)，48.8(d，C-5)，26.4(t，C-6)，42.8(d，C-7)，41.2(s，C-8)，40.1(d，C-9)，45.1(d，C-10)，51.5(s，C-11)，29.7(t，C-12)，46.9(d，C-13)，211.3(s，C-14)，30.6(t，C-15)，79.7(d，C-16)，77.4(d，C-17)，26.6 (q，C-18)，57.1(t，C-19)，50.4(t，C-21)，13.5(q，C-22)，55.9(q，1-OMe)，56.8(q，16-OMe)。以上数据与文献[23]基本一致，故化合物10鉴定为vilmoraconitine。

化合物11无色油状液体；HR-ESI-MS：m/z402.276 0[M + H]+；分子式C24H35NO4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.05(3H，t，J=7.2 Hz，H-22)，3.27、3.29、3.37(各3H，s，3×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：79.9(d，C-1)，24.5(t，C-2)，33.1(t，C-3)，39.4(s，C-4)，44.3(d，C-5)，26.4(t，C-6)，43.0(d，C-7)，41.0(s，C-8)，40.1(d，C-9)，45.1(s，C-10)，51.2(s，C-11)，29.6(t，C-12)，46.9(d，C-13)，211.1(s，C-14)，30.5(t，C-15)，79.8(d，C-16)，79.6(d，C-17)，77.8 (t，C-18)，53.5(t，C-19)，50.4(t，C-21)，13.5(q，C-22)，55.9(q,1-OMe)，56.8(q，16-OMe)，59.6(q，18-OMe)。以上数据与文献[24]基本一致，故化合物11鉴定为aconitramine A。

化合物12白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z376.249 1[M + H]+；分子式C22H33NO4。1H NMR(600 MHz，CDCl3)δ：1.09(3H，s，H-18)，3.12、3.23、3.37(各3H，s，3×OMe)，7.20(1H，s，H-19)；13C NMR(150 MHz，CDCl3)δ：84.8(d，C-1)，26.0(t，C-2)，32.7(t，C-3)，45.8(s，C-4)，46.7(d，C-5)，25.1(t，C-6)，47.4(d，C-7)，77.3(s，C-8)，45.3(d，C-9)，46.3(d，C-10)，48.3(s，C-11)，27.9(t，C-12)，37.7(d，C-13)，75.3(d，C-14)，32.0(t，C-15)，82.1(d，C-16)，61.9(d，C-17)，23.0(q，C-18)，169.2(d，C-19)，56.2(q，1-OMe)，48.6(q，8-OMe)，56.6(q，16-OMe)。以上数据与文献[25]基本一致，故化合物12鉴定为vilmorrianine G。

化合物13无色油状液体；HR-ESI-MS：m/z404.279 8[M + H]+；分子式C24H37NO4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.05(3H，t，J=7.1 Hz，H-22)，3.24、3.30、3.39(各3H，s，3×OMe)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：84.9(d，C-1)，26.1(t，C-2)，33.8(t，C-3)，37.6(s，C-4)，137.4(s，C-5)，119.0(d，C-6)，22.3(t，C-7)，46.9(t，C-8)，48.5(s，C-9)，37.3(d，C-10)，40.9(s，C-11)，36.4(t，C-12)，49.0(d，C-13)，218.2(s，C-14)，37.5(t，C-15)，80.1(d，C-16)，50.5(t，C-17)，78.6(t，C-18)，54.5(t，C-19)，52.7(t，C-21)，12.5(q，C-22)，54.8(q，1-OMe)，56.1(q，16-OMe )，59.4(q，18-OMe)。以上数据与文献[26]基本一致，故化合物13鉴定为hemsleyaconitine G。

化合物14白色无定形粉末；HR-ESI-MS：m/z384.220 2[M + H]+；分子式C23H29NO4。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.45(3H，s，H-18)，2.02(3H，s，2-OAc)，2.33(3H，s，H-21)；13C NMR(100 MHz，CDCl3)δ：35.9(t，C-1)，71.0(d，C-2)，43.4(t，C-3)，36.9(s，C-4)，63.2(d，C-5)，203.7(s，C-6)，50.5(t，C-7)，41.9(s，C-8)，59.3(d，C-9)，44.6(s，C-10)，22.8(t，C-11)，52.9(d，C-12)，211.8(s，C-13)，50.5(d，C-14)，44.0(t，C-15)，142.3(s，C-16)，110.7(t，C-17)，31.3(q，C-18)，60.5(t，C-19)，68.6(d，C-20)，43.4(q，C-21)，170.0(s，2-MeCO)，21.7(q，2-MeCO)。以上数据与文献[27]基本一致，故化合物14鉴定为heterophylloidine。

3.2 活性测试结果

结果表明，化合物浓度在40 μmol/L时，3、10、11和12表现出一定的保护活性，其细胞存活率分别为69.92%、64.90%、74.86%和69.90%(阿霉素的细胞存活率为61.49%)。

4 结论

本研究对丽江乌头干燥块根进行了二萜生物碱成分的研究，共分离得到1个新的乌头碱型C19-二萜生物碱和13个已知化合物。分离得到的化合物结构类型涉及：9个乌头碱型C19-二萜生物碱、2个重排型C19-二萜生物碱、1个7，17次裂型C19-二萜生物碱和1个海替定型C20-二萜生物碱。除化合物4和9外，其余化合物均为首次从该植物中分离得到。发现丽江乌头中除了乌头碱型还有其他类型的C19-二萜生物碱与C20-二萜生物碱，丰富了丽江乌头的化学成分结构类型，也为阐明丽江乌头药效物质基础提供了一定依据。同时考察了化合物对阿霉素诱导的H9c2心肌细胞损伤的保护活性，发现在浓度40 μmol/L时，化合物3、10、11和12表现出了一定的保护活性。因此为发现能够减少因化疗药物副作用所致心肌损伤的新药和深入研究二萜生物碱的活性提供了线索。