郭永春，王淑燕，王鹏杰，陈金发，周 鹏，欧阳立群，赵 峰，叶乃兴*

1福建农林大学园艺学院/茶学福建省高校重点实验室，福州 350002；2福建中医药大学药学院，福州 350122；3国家茶叶质量安全工程技术研究中心，安溪 362400；4福建省产品质量检验研究院，福州 350002

茶树Camelliasinensis(L.) O.Kuntze是一种多年生叶用经济作物，在世界上多个国家被广泛种植[1]。杂草可与茶树争夺肥水和生长空间，影响茶叶产量和品质[2]，草甘膦是一种常见的内吸传导型除草剂，具有高效、廉价和杀草谱广等优点，近几十年来在茶园杂草管理中被广泛应用[1]。现阶段，我国的福建、贵州等部分省份已通过地方法规限制茶园使用草甘膦，但生产中依旧难以避免由于不合理用药导致的茶园草甘膦污染[3]。

草甘膦具有广谱性，在杀灭杂草的同时，也会被作物根部吸收并转运至全株，影响作物生长代谢[4]。其作用机理是通过干扰植物莽草酸代谢途径，影响芳香氨基酸的合成，使植物代谢紊乱，因此草甘膦作用于植物莽草酸代谢的过程必然会影响农作物的品质[5]。已有研究表明，草甘膦施用后，玉米[6]、马铃薯[5]和柑橘[7]等农作物的产量下降。也有学者开始关注草甘膦对茶树生长和代谢的影响，例如，Gao等[8]指出，茶园施用田间推荐剂量的草甘膦除草剂后，茶树地上部未有药害表征；Tong等[9]通过水培体系研究发现，草甘膦经茶树根部吸收后转运到叶部，极有可能是茶叶中草甘膦残留的主要途径。本课题组前期通过对幼龄和成年茶树施用草甘膦发现，喷洒到土壤的草甘膦被茶树根部吸收后，经茎部转运富集至叶部[10]。目前，草甘膦的施用对茶树叶片主要生化成分(如：氨基酸、儿茶素和生物碱)的具体影响尚未见报道。

本研究通过观察草甘膦施用后茶树叶片的表观药害，并对草甘膦施用前(0天)和施用后(7和33天)茶树叶片中的农药残留(草甘膦和氨甲基膦酸)及主要生化成分(儿茶素、生物碱和氨基酸)进行定量测定，从而探究草甘膦施用后茶树叶片的表观药害、草甘膦在茶树叶片中的代谢情况及其施用对茶叶主要生化成分的具体影响，相关试验结果可为草甘膦在茶叶生产质量的安全管控方面提供参考。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 材料处理及制备

以全国优良品种金观音(C.sinensis‘Jin-guanyin’)一年生茶树为试验材料，将泥炭土和珍珠岩按照1∶1(体积比)混匀后作栽培基质。将茶树植于体积为2 L的盆钵并进行2个月的适应性培养，选取长势基本一致的植株，于2019年10月将草甘膦异丙胺盐定量施于栽培基质上，具体方法为：(1)分别将45、450和900 mg/mL的草甘膦施于栽培基质(每单位体积土壤基质的施用量，即浓度分别为0.3 mg/mL(低于推荐施用浓度)、3 mg/mL(推荐施用浓度)和6 mg/mL(高于推荐施用浓度)的草甘膦在每个盆钵(2 L)定量喷施300 mL)，取茶树叶片进行药害表征观察。(2)将45 mg/mL的草甘膦施于栽培基质(浓度为0.3 mg/mL的草甘膦在每个盆钵(2 L)定量喷施300 mL)，分别于0(施用前)、7和33天采集茶树嫩梢第二三叶(每个时期6次生物学重复)，采集后的样品以液氮速冻，通过冷冻干燥机干燥后，放入研钵磨碎成粉，用于农药残留及茶叶品质化学组分的测定。

1.1.2 仪器与试剂

仪器：超高效液相色谱-串联质谱(UPLC-MS/MS，美国Agilent公司)；超高效液相色谱串联-飞行时间质谱连用仪(UPLC-TOF-MS，美国Wateser-G2-S公司)。

试剂：草甘膦异丙胺盐(有效成分30%，山东三农生物科技有限公司)；草甘膦标准品草甘膦内标(1，2-C13N15草甘膦，上海安谱有限公司)；乙酸铵、甲酸和36%盐酸(色谱纯，西陇科学股份有限公司)；十水四硼酸钠和磷酸二氢钾(分析纯，西陇科学股份有限公司)；甲酸铵(试剂级，西陇科学股份有限公司)；乙腈和甲醇(色谱级，山东禹王和天下新材料有限公司)；氯甲酸-9-芴基甲酯(FMOC-Cl，分析纯，纯度不低于99.0%，上海源叶生物科技有限公司)；60 mg/3 mL阳离子交换柱(PCX,博纳艾杰尔科技公司)；氨基酸衍生试剂盒(美国Waters公司)。

茶氨酸(theanine，Thea)、天冬酰胺(asparagine，Asn)、谷氨酰胺(glutamine，Glu)、豆叶氨酸和L-胱氨酸购自成都德思特生物技术公司；氨基酸混合标准储备液购自美国Sigma公司，包括：天冬氨酸(aspartic acid，Asp)、谷氨酸(glutamic acid，Glu)、丝氨酸(serine，Ser)、甘氨酸(glycine，Gly)、组氨酸(histidine，His)、苏氨酸(threonine，Thr)、丙氨酸(alanine，Ala)、精氨酸(arginine，Arg)、色氨酸(tryptophan，Try)、脯氨酸(proline，Pro)、酪氨酸(tyrosine，Tyr)、缬氨酸(valine，Val)、蛋氨酸(methionine，Met)、赖氨酸(lysine，Lys)、苯丙氨酸(phenylalanine，Phe)、瓜氨酸(citrulline，Cit)、肌氨酸(sarcosine，Sar)、异亮氨酸(isoleucine，Ile)、乙醇胺(ethanolamine，EOHNH2)、鸟氨酸(ornithine，Orn)、DL-β-氨基异丁酸(β-aminoisobutyric acid，β-AiBA)、l-α-氨基己二酸(α-aminoadipate，α-AAA)、γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)、L-亮氨酸(leucine，Leu)、羟赖氨酸(hydroxylysine，Hy-Pro)、L-肌肽、半胱氨酸、羟基-L-脯氨酸、尿素、鹅肌肽、牛磺酸、δ-1-甲基-L-组氨酸、高胱氨酸、L-α-氨基丁酸、3-甲基-L-组氨酸、β-丙氨酸、L-肌酸酐、胱硫醚、氯化铵；儿茶素(catechin，C)、表儿茶素(epicatechin，EC)、表没食子儿茶素没食子酸酯(epigallocatechingallate，EGCG)、表没食子儿茶素(epigallocatechin，EGC)、表儿茶素没食子酸酯(epicatechin gallate，ECG)、没食子儿茶素(gallocatechin，GC)、没食子儿茶素没食子酸酯(gallic acid catechin gallate，GCG)、儿茶素没食子酸酯(catechin gallate，CG)等8种儿茶素单体标准品购自香港Farco chemical supplies公司；茶叶碱和咖啡碱(caffeine，CA)标准品购自香港Farco chemical supplies公司；可可碱(theobromine，TB)标准品购自Stanford Chemicals公司，标准品纯度均大于98%。

1.2 测定指标及方法

1.2.1 草甘膦及氨甲基磷酸的测定

按照SN/T 3983-2014《出口食品中氨基酸类有机磷除草剂残留量的测定 液相色谱-质谱/质谱法》以UPLC-MS/MS测定样品中的草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸的含量。

1.2.2 游离氨基酸及其衍生物的测定

按照Chen等[11]的方法，具体如下：称取0.050 g待测茶样，加纯水定容至5 mL，涡旋混匀，于25 ℃超声提取30 min，上清液移入离心管离心5 min，取10 μL经0.22 μm PTFE滤膜过滤的提取液与70 μL AccQ-Fluor硼酸盐缓冲液(PH=8.8)混合，加入20 μL AccQ-Fluor试剂(3 g/L)，涡旋后于55 ℃烘箱中反应10 min，冷却至室温后采用UPLC-MS/MS进行测定。

色谱条件：HSS T3 C18色谱柱(Waters,2.1×150 mm,1.8 μm)；柱温：40 ℃；流动相A：甲酸铵水溶液(10 mmol/L)，流动相B：乙腈；流速：0.3 mL/min；洗脱梯度：0～12 min，0%→20% B；12～16 min，20%→35% B；16～18 min，35%→90% B；18～20 min，90%→5% B；进样体积：0.5μL。质谱条件：电喷雾电离，正离子模式；多反应监测模式；电喷雾电压，4.5 kV；气帘气压力：0.21 MPa；雾化气压力：0.38 MPa；辅助气压力：0.38 Mpa；辅助气温度550 ℃。

1.2.3 生物碱和儿茶素组分的测定

按照Zhou等[12]的方法，具体如下：称取0.100 g待测茶样，加提取液(甲醇∶乙腈∶水=2∶1∶3，V/V)定容至5mL，涡旋后于室温下超声提取30 min，15 000 rpm离心3 min，取上清液至离心管，过0.22 μm PTFE滤膜后采用超高效液相色谱串联-飞行时间质谱连用仪UPLC-TOF-MS进行测定。

色谱条件：HSS T3色谱柱(Waters,100×2.1 mm，1.8 μm)；柱温：40 ℃；流动相 A：0.1 %甲酸，流动相 B：乙腈；流速：0.3 mL/min。梯度洗脱程序：0～10 min，95%→75% B；10～13 min，75%→48% B；13～15 min，48%→20% B；15～15.01 min，20%→5% B；15.01～17 min，5%B；17～17.01 min，5%→95% B；进样体积：5 μL。质谱条件：电喷雾电离，负离子模式；毛细管电压：2.5 kV；扫描范围：50～1 200 Da；离子源温度：120 ℃；去溶剂化温度：400 ℃；去溶剂化流速：800 L/h。

1.3 数据统计与分析

通过Excel 2010进行数据统计，以“平均值±标准偏差”表示每个处理组的试验结果；采用IBM SPSS Statistics 19.0的ANOVA进行组间差异显著性分析；将游离氨基酸、生物碱和儿茶素的定量结果进行标准化处理后以Tbtools绘制热图；采用SIMCA P 14.1软件进行偏最小二乘法判别分析(PLS-DA)；采用Origin 2019软件作柱状图。

2 结果与分析

2.1 草甘膦施用后茶树叶片的药害表征及其残留

由图1A可知，45、450和900 mg/L的草甘膦施用33天，相较于未施药前(0天)，茶树生长正常，叶片未出现干枯、皱缩和脱落等常见药害表征。现阶段，国家食品安全标准GB 2763—2019规定茶叶中草甘膦的最大残留限量(maximum residue limits，MRLs)为1.0 mg/kg[3]，如图1 B所示，即使在45 mg/L较低施药剂量下，茶树叶片在7天和33天均检测到草甘膦及其主要代谢物氨甲基膦酸(aminomethylphosphonic acid，AMPA)残留。叶片中的草甘膦含量在7天较高，达到2.6 mg/kg(大于MRLs)，在33天已降低至0.33 mg/kg(小于MRLs)；AMPA含量在7天达0.21 mg/kg，在33天降低至0.08 mg/kg。

图1 草甘膦施用不同时间后的叶片表征(A)及茶树叶片中的草甘膦和氨甲基膦酸含量(B)Fig.1 Observation of the phytotoxicity (A) and the content of PMG and AMPA in tea leaves (B) under the spraying of PMG at different times

2.2 草甘膦对茶树叶片游离氨基酸含量的影响

本试验样品共定量到28个游离氨基酸组分(见表1)，其中的27个游离氨基酸组分的含量在施药后发生显著性变化(P<0.05)，游离氨基酸总量在草甘膦施药7天和33天均显著降低(P<0.05)。茶氨酸的含量在7天和33天下降较明显，降幅分别达到38.03%和62.03%；苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量在草甘膦施用后7天升高，在施用后33天降低并低于施用前(0天)。此外，谷氨酸、谷氨酰胺、天冬氨酸、甘氨酸、组氨酸、蛋氨酸、鸟氨酸的含量在7天和33天均显著降低；肌氨酸、羟脯氨酸、赖氨酸和精氨酸的含量在草甘膦喷施后7天变化不显著，在3天后显著上升；苏氨酸、丙氨酸和γ-氨基丁酸在7天变化不显著，在33天显著降低；脯氨酸、缬氨酸、天冬酰胺、异亮氨酸、乙醇胺、L-2-氨基己二酸和丝氨酸的含量在7天显著升高，在33天显著降低；β-氨基异丁酸和亮氨酸在7天显著升高，在33天变化不显著。

表1 草甘膦施用对茶树叶片游离氨基酸组分含量的影响(n=6)

2.3 草甘膦对茶树叶片儿茶素类化合物含量的影响

本试验共有6个儿茶素组分的含量高于定量限(见表2)，其中，6个儿茶素组分的样品组间存在显著性差异(P<0.05)，儿茶素总量在草甘膦施用后7天和33天均显著下降。此外，草甘膦施用后，C和EC的含量在7天降低，在33天升高；而EGC和GC的含量在7天升高，在33天降低；ECG和EGCG(酯型儿茶素)的含量在7天和33天均下降。

表2 草甘膦施用对茶树叶片儿茶素组分含量的影响(n=6)

2.4 草甘膦对茶树叶片生物碱类化合物含量的影响

本试验样品共定量到2个生物碱组分(见表3)，2种生物碱组分的样品组间均存在显著性差异(P<0.05)，生物碱总量在草甘膦施用后7天显著升高，在33天显著下降。可可碱的含量在7天和33天均持续性地显著降低，而咖啡碱的含量在7天显著上升，在33天显著降低且低于处理前(0天)。

2.5 草甘膦对茶树叶片主要生化成分影响的多元统计分析

2.5.1 热图可视化分析

为更直观地反映各组间样品的含量变化规律及组内样品的聚集模式，将上述生物碱、儿茶素和游离氨基酸组分的定量结果进行标准化并绘制热图。如图2所示，组内样品聚集良好，组间样品得以完全区分。36种化学组分按照其含量变化特征聚为两类：A类中的7个组分含量在33天明显升高，B类中的27个组分含量在33天明显下降。其次，A1类4个组分含量在7天变化不明显，A2类3个组分含量在7天下降；B1类18个组分含量在7天升高，B2类9个组分含量在7天下降，GC和Cit的变化趋势不明显。

表3 草甘膦施用对茶树叶片生物碱含量的影响(n=6)

图2 草甘膦施用后茶树叶片中36种化学组分的含量热图Fig.2 Heat map of 36 chemical components in tea leaves after glyphosate applying注：颜色刻度表示标准化转换后的值，蓝色表示低含量水平；红色表示高含量水平。Note:The color scale indicates the standardized converted value,blue indicates a low content level;red indicates a high content level.

2.5.2 偏最小二乘判别分析(PLS-DA)

为进一步确定各组样品间的差异，对36种茶叶代谢组分进行偏最小二乘判别分析(PLS-DA)。由图2A可知，模型累积方差贡献率为95.3%，预测准确率为98.5%，表明了该模型用于区分样品的可行性。图3B显示了PLS-DA模型的交叉验证结果，图中左侧所有的R2和Q2点均低于最右侧的R2和Q2原始点，纵轴低截距(R2=0.174，Q2=-0.361)进一步表明原始模型的有效性。由图2 B可知，0天、7天和33天的样品分别位于第四、一和三象限，0天和7天的样品在t[2]轴上完全分开，0天和33天的样品在t[1]轴上完全分开，7天和33天的样品需t[1]轴和t[2]轴相结合才能区分。由此可见，草甘膦喷施后7天和33天的样品差别较小，而与草甘膦喷施前的样品(0天)存在较大差异。

如图3D所示，共有10种化合物的VIP(variable importance for the projection,VIP)值大于1，变量VIP值由高至低依次是茶氨酸(Thea)、咖啡碱(CA)、表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)、谷氨酰胺(Gln)、表儿茶素没食子酸酯(ECG)、表儿茶素(EC)、精氨酸(Arg)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)和表没食子儿茶素(EGC)。此外，这10种化合物在因子载荷图(见图3C)中发现这些化合物均属于离密集区较远的变量。

3 讨论

3.1 草甘膦施用后茶树叶片的表观药害及农药残留情况

Tong等[9]研究发现，水培营养液中的草甘膦浓度达到200 mg/L时，茶树叶片会出现黑褐色斑点；Gao等[8]研究发现，推荐剂量的草甘膦喷洒到茶园后，茶树嫩梢生长正常。课题组前期研究发现，1.5～15 g/m2剂量的草甘膦喷洒到成年茶树根部后，茶树地上部未观察到药害产生[10]。本试验与后二者研究结果相似，45～900 mg/L剂量的草甘膦喷洒到幼龄茶树的栽培基质后，茶树生长正常。此外，在45 mg/L较低施药剂量下，茶树叶片在7天检测到较高草甘膦(大于MRLs)及AMPA残留，在较长施用间隔期后(33天)仍可检测到少量草甘膦(小于MRLs)及AMPA残留。AMPA 作为草甘膦的主要降解产物，是一种植物毒素，对哺乳动物具有长期的毒性作用[13]，说明茶园草甘膦的施用不易使茶树叶片产生药害表征，但在叶片中残留时间久且存在草甘膦残留超标及AMPA生物毒性的风险。

3.2 草甘膦对茶树叶片主要生化成分的影响

草甘膦通过抑制植物莽草酸代谢途径中的关键酶活性，影响3种芳香氨基酸(苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸)的生物合成[14]。本研究显示，苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的含量在草甘膦施用后7天升高，在33天降低并低于施用前(0天)，原因可能是茶树在初期对草甘膦产生逆境响应，3种氨基酸的含量升高，而后草甘膦持续抑制EPSPS活性，最终导致3种氨基酸的含量下降。草甘膦作用于植物莽草酸代谢的过程可间接影响生物碱类化合物和部分次生代谢物(如：茶氨酸和儿茶素)的合成[15]。Malalgoda等[16]指出，草甘膦对小麦的氨基酸代谢具有负面影响；Rainio等[17]通过对马铃薯的土壤基质进行草甘膦处理，发现植株内的糖苷生物碱浓度下降。与之研究结果相似，草甘膦施用后，茶叶中的特征氨基酸—茶氨酸含量大幅降低，可可碱、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯含量显著下降，说明施用草甘膦可能通过抑制莽草酸代谢途径，间接阻止这些化合物的生物合成。此外，游离氨基酸、儿茶素和生物碱的总量及其组分构成，对茶叶品质具有重要作用[18]。草甘膦施用后，游离氨基酸和儿茶素总量降低，生物碱总量先升后降；2个生物碱、5个儿茶素和27个游离氨基酸组分的含量发生显著变化(P<0.05)。说明施用草甘膦改变了茶树叶片中游离氨基酸、儿茶素和生物碱类化合物的总量及其组分构成，影响鲜叶品质。

PLS-DA模型的因子载荷图中离密集区越远的变量对分类越关键[19]，VIP总结变量X(代谢组分)和自变量Y(样品)相关性，VIP值大于1，表示该代谢组分对样品组间区分的贡献较大[20]，共有10个化合物的VIP值大于1，且在因子载荷图中属于离密集区较远的变量，依次是茶氨酸、咖啡碱、表没食子儿茶素没食子酸酯、谷氨酰胺、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表没食子儿茶素。此外，这10个化合物的绝对含量在0、7和33天均具有显著差异(P<0.05)，因此，这10个化合物是区分茶树草甘膦施用前(0天)和施用后(7天和33天)的关键化合物。

4 结论

草甘膦在茶树叶片中残留时间较长，并存在草甘膦残留超标及AMPA生物毒性的风险；其次，草甘膦的施用能够间接阻止茶树叶片中茶氨酸、可可碱、表儿茶素没食子酸酯和表没食子儿茶素没食子酸酯等组分的合成，并改变茶树嫩梢的游离氨基酸、儿茶素和生物碱类化合物的总量及其组分构成，最终影响鲜叶品质。此外，通过多元统计分析筛选出10个茶树草甘膦施用前后差异较大的关键化合物，变量VIP值由高至低依次为：茶氨酸、咖啡碱、表没食子儿茶素没食子酸酯、谷氨酰胺、表儿茶素没食子酸酯、表儿茶素、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和表没食子儿茶素。因此，建议在茶叶生产中尽量不使用草甘膦除草剂。