陶志杰，胡瑞瑞，颜成瑞，卢梦婷，贾付康

(蚌埠学院 食品与生物工程学院，安徽 蚌埠 233030)

白藜芦醇，二苯乙烯类化合物，具有预防肿瘤，降低血小板聚集，治疗动脉粥样硬化，预防心脑血管疾病的功能[1]，现已在多个领域如食品、保健、临床医学、化妆品等得到应用[2-4]。白藜芦醇来源于植物体内，主要有葡萄、虎杖、花生、桑葚等。白藜芦醇是植物在受到外界胁迫时产生的植物抗毒素[5]。目前，白藜芦醇主要从虎杖、酿酒副产品葡萄渣中回收，通过优化提取工艺以获得更高的提取率[6]。

植物细胞培养生产抗癌多酚的研究是生物工程新战略。从植物细胞培养物中回收二苯乙烯可以被认为是一种新的二苯乙烯来源[7]，已有研究者对葡萄等细胞培养产白藜芦醇进行相关研究[8-9]。白藜芦醇生物合成诱集方法主要包括生物诱集和非生物诱集[9-10]。生物诱集是利用微生物侵染植物体，诱导植物体产生相关合成酶，从而合成白藜芦醇。非生物诱集是利用物理[11-12]、化学[13-14]等因素刺激植物，诱发植物产生大量的白藜芦醇。生物诱导并非所有微生物都有效果，需要通过实验寻找微生物物种。而目前发现较为有效的非生物诱导方法主要有机械力、紫外照射、超声波等作用[15]，研究表明，通过该类方法诱导植物体，白藜芦醇含量可获得数倍甚至数百倍的增长。诱集法是当前白藜芦醇合成方法的研究热点之一。本研究利用物理复合方法诱导培养花生芽组织块细胞制取白藜芦醇，并利用正交试验设计法对诱导条件进行优化，以期为花生芽组织悬浮培养产白藜芦醇提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

花生品种：鲁花一号花生带壳种子，购于京东绿友园林专营店。

主要试剂：白藜芦醇标准品(分析标准品≥98%，阿拉丁)，蔗糖、硫酸铜、无水乙醇等均为分析纯。

主要仪器：FA214电子天平(上海海康电子仪器厂)；微电脑智能控制豆芽机DYJ-S6031(小熊牌)。内切式匀浆机(宁波新芝生物科技股份有限公司)；JBQ-ZD全温振荡器(常州普天仪器制造有限公司)；JW-3021H高速离心机(安徽嘉文仪器装备有限公司)；UV-9000型双光束紫外可见分光光度计(上海元析科技仪器有限公司)。

1.2 试验方法

1.2.1花生催芽及消毒

利用豆芽机进行花生发芽，待发芽5天时采收。选取健康粗壮的花生芽，去根和子叶，留茎杆，用体积分数75%乙醇消毒待用[16]。

1.2.2花生芽茎细胞诱导培养

称取上述消毒花生芽茎2.00 g，切成1 cm小段，加入40 mL花生芽培养液(600 μmol/L CuSO43%蔗糖溶液)，在内切式匀浆机下以不同转速，不同处理时间对花生芽茎细胞进行剪切力诱导，待花生芽茎组织块分散后放入恒温振荡箱，紫外照射不同时间对花生芽细胞进行诱导。紫外照射处理后，在25 ℃下避光培养不同时间。待培养结束，提取白藜芦醇，测定含量。

1.2.3白藜芦醇标准曲线绘制

准确称取白藜芦醇标准品10.0 mg，在50 mL容量瓶中添加白藜芦醇标准品后用甲醇定容，稀释摇匀，再取3 mL于25 mL容量瓶中用甲醇定容，吸取标准液 0、1、2、3、4、5 mL，再次分别定容25 mL，然后逐一测其在306 nm处的吸光值，测定3次，求平均值，绘制标准曲线。得到回归方程和相关系数：

Y=0.1342X-0.0350，R2=0.9970

1.2.4白藜芦醇含量的测定

将不同处理的花生细胞悬浮液，在高速匀浆机10000 r/min，1 min条件下破碎细胞。细胞破碎后，60 ℃水浴中乙醇浸提2 h。浸提结束后，在6000 r/min下离心1 min，取上清液在306 nm波长下测定白藜芦醇吸光度[17]，通过公式计算白藜芦醇含量:

W=(CVn)/M

式中：W为材料中白藜芦醇的含量(μg/g)，M为花生芽的质量(g)，V为花生细胞提取液体积(mL)，n为稀释倍数，C为提取液白藜芦醇的浓度(μg/mL)

1.2.5白藜芦醇富集培养条件的单因素试验

按1.2.2节方法诱导，在不同试验条件下进行恒温培养，根据培养液中白藜芦醇含量测定结果，考察：剪切速度：不同转速3000、4000、5000、6000、7000 r/min，剪切18 s，紫外照射30 min，培养24 h；剪切时间：在4000 r/min转速下，分别剪切0、6、12、18、24 s，紫外照射30 min，培养24 h；紫外照射时间：在4000 r/min转速下剪切18 s，分别紫外照射0、10、30、50、70、90 min，培养24 h；培养时间：在4000 r/min转速下剪切18 s，紫外照射30 min后，分别培养16、20、24、28、40 h。培养结束后，按1.2.4节方法测定白藜芦醇含量。

1.2.6物理诱导培养合成白藜芦醇的正交试验

在物理诱导作用下，白藜芦醇富集培养条件单因素试验基础上，研究紫外照射时间(A)、培养时间(B)、剪切时间(C)、剪切速度(D)四个因素对白藜芦醇含量的影响。进行4因素3水平正交试验，采用L9(34)正交试验设计方案进行诱导条件优化，因素水平见表1。

表1 正交因素水平表

1.2.7验证试验

取三份批次相同的花生芽组织块，分别放入100 mL烧杯中，以优化得出的最佳诱导条件培养，其余条件保持一致。按1.2.2节方法提取白藜芦醇，测定含量，取平均值，验证试验的可重复性。

1.2.8比较试验

取九份相同批次的花生芽，一组花生芽直接提取白藜芦醇，重复三次；一组花生芽未经过诱导条件处理，重复三次；一组花生芽以实验所得最佳诱导条件处理，重复三次。比较三种不同条件中花生芽白藜芦醇含量变化情况，得出物理诱导处理方式对白藜芦醇含量差异的影响结果。

2 结果与分析

2.1 剪切速度对花生芽白藜芦醇含量的影响

图1 剪切速度对花生芽白藜芦醇含量的影响

由图1可知，随着剪切力度的增加，花生芽茎细胞会受到刺激而产生白藜芦醇，但当剪切速度达到4000-5000 r/min时，由于剪切力度过大，超过细胞承受能力而受损，白藜芦醇合成降低。因此，当剪切速度合适的时候对花生细胞产白藜芦醇呈正向激发。

2.2 剪切时间对花生芽白藜芦醇含量的影响

由图2可知，各组处理中剪切时间为12 s时，花生芽茎细胞合成白藜芦醇含量最高。

图2 剪切时间对花生芽白藜芦醇含量的影响

在相同转速条件下，随着剪切时间的延长，白藜芦醇含量呈上升趋势，在最高峰时达(275±7.253) μg/g，比对照组提高了56.3%。再次证明剪切力大小对花生细胞产白藜芦醇有刺激作用。随着剪切时间的延长，剪切力度增大，导致细胞受损，代谢产物随之减少。

2.3 紫外照射时间对花生芽白藜芦醇含量的影响

资料显示，紫外照射对植物合成白藜芦醇有诱导作用(见图3)。

图3 紫外照射时间对花生芽白藜芦醇含量的影响

从图3中可以看出，固定紫外照射强度，随着照射时间的延长，白藜芦醇含量呈现先上升后下降的趋势。当紫外照射时间达10 min时，白藜芦醇含量达到最大值(566±14.385) μg/g，是对照组的2.0倍。紫外照射组均比对照组的白藜芦醇含量高，说明紫外照射对花生细胞产白藜芦醇有诱导作用。

2.4 培养时间对花生芽白藜芦醇含量的影响

通过剪切和紫外照射复合处理后，花生细胞在25 ℃恒温培养箱中培养。由图4可知，培养时间为20 h时白藜芦醇含量达到峰值。

第四，实行绿色生产：推广生物肥料，施用农家肥；使用治标又治本的植物农药；秸秆还田，改良土壤，减轻对化肥的依赖，减少环境污染。

图4 培养时间对花生芽白藜芦醇含量的影响

随着培养时间的延长，白藜芦醇含量减少，超过28 h后，急剧下降。由于细胞受到刺激，产生应激反应后无法正常生长，白藜芦醇含量出现急剧下降。因此，通过花生细胞培养产白藜芦醇适宜的培养时间为20 h。

2.5 花生芽茎细胞物理诱导培养的优化试验结果

2.5.1正交试验结果

花生芽组织块悬浮培养产白藜芦醇的正交试验结果见表2，方差分析结果见表3。

表2 花生芽产白藜芦醇的正交试验结果

表3 花生芽产白藜芦醇正交试验结果方差分析

由表2、表3可知，在花生芽组织块细胞培养产白藜芦醇的研究试验过程中，紫外时间、培养时间、剪切时间、剪切速度四因素对白藜芦醇产量的影响大小为A﹥B﹥C﹥D，即紫外时间﹥培养时间﹥剪切时间﹥剪切速度。最优组合条件为A2B2C2D1：紫外处理时间为10 min，培养时间为 20 h，剪切时间为12 s，剪切速度为 4000 r/min。此外，还可以看出剪切力对细胞产白藜芦醇有影响但不显著，紫外照射时间对白藜芦醇产量的影响表现极显著，证明了紫外照射一定时间对花生芽细胞产白藜芦醇有很大的影响，细胞培养20 h为最佳收集期。

2.5.2验证试验结果

取3份根据上述最优条件诱导处理培养的花生芽细胞团，测得悬浮培养花生芽茎细胞中白藜芦醇平均含量为(585±15.752) μg/g，相对标准偏差RSD=2.8%，表明该培养条件稳定可行，重现性较好。

2.5.3比较试验结果

通过三组不同试验条件测定其白藜芦醇含量，结果见表4。

表4 比较试验结果

未经培养，直接从花生芽茎中提取白藜芦醇，得到平均含量为(154±3.832) μg/g，未经物理诱导处理直接培养后提取白藜芦醇的结果比第一组的增长了41%。通过人工物理诱导刺激花生芽茎细胞培养后，其白藜芦醇含量大幅度增加，增长率为284%，是第一组白藜芦醇含量的3.8倍。因此可以得出，紫外照射和机械剪切物理诱导对花生芽茎细胞产白藜芦醇有明显地刺激作用。

3 结论

本研究通过单因素试验对物理法诱导花生芽细胞富集白藜芦醇条件进行优化。采集发芽5天的花生芽茎，在剪切速度4000 r/min下剪切12 s，通过紫外照射10 min后再培养20 h。在此条件下测得悬浮培养花生芽茎细胞中白藜芦醇平均含量为(585±15.752) μg/g。通过人工物理诱导刺激花生芽茎细胞培养后，其白藜芦醇含量增长率为284%。实验中采用紫外分光光度计法测定白藜芦醇含量应比HPLC法测定值偏高。虽然存在偏差，但仍可测定出物理诱导对花生芽细胞产白藜芦醇的显著差异。后续实验将会对细胞进行显微观察，掌握细胞生长状态与产白藜芦醇的关系。本研究利用了花生芽茎组织块悬浮培养合成白藜芦醇，与黄卫文[18]的方法相比较，具有培养液无需灭菌、培养时间短、操作简单等优点，可以为植物细胞培养产白藜芦醇提供了新途径。