李福敏，邵 林，杨艳华，吴明江，赵海云，杨丽芬

(1.大理州食品检验检测院，云南 大理 671000；2.昆明学院 化学化工学院，云南 昆明 650214；3.云南警官学院，云南省刑事科学技术重点实验室，毒品分析及禁毒技术公安部重点实验室，云南 昆明 650223)

西红花是一种药食同源性、传统的名贵中药材，具有活血化瘀，凉血解毒、解郁安神之功效，素有“植物黄金”之美誉[1-2].人工种植是其主要来源，为保证西红花的质量和产量，种植过程中难免的会出现农药滥用甚至农药残留超标的现象，成为西红花走向世界的瓶颈.为了西红花产业健康持续发展，建立西红花中多农药残留的快速分析方法显得尤为重要.

现行《中国药典》2015版通则2341[3]记载采用气相色谱串联质谱法检测药材中74种农药残留的方法，但检测的绝大多数农药为有机氯类和拟除虫菊酯类，并且分析时间较长，超过 40 min.有学者对近年药材农药残留情况普查发现：花类药材农药残留的检出率较高、残留情况较复杂、部分品种属药食同源类[4].目前，国内外有关西红花中有机磷农药残留的研究鲜有报道.有机磷农药残留检测以气相色谱法(gas chromatography, GC)最为常见，但分析复杂样品时易受杂质和背景噪音的干扰.与GC相比，气相色谱串联质谱法(gas chromatography-triple quadrupole tandem mass spectrometric, GC-MS/MS)具有抗干扰能力强、灵敏度高和定量准确等优点，对分析基质复杂的样品具有一定优势.

本研究在《中国药典》2015版通则2341方法的基础上，优化QuEChERS[5]前处理方法，利用基质匹配标准工作液校准，经GC-MS/MS采取多反应离子监测模式(multiple reaction monitoring, MRM)分析，建立了一种快速、准确、高效检测西红花中9种有机磷农药残留的方法.

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent 7890B-7000C气相色谱串联质谱仪，配备7693自动进样器(美国Agilent公司)；QUINTIX-1CN电子天平(感量 0.1 mg，德国Sartorius公司)；VORTEX 2混匀器(德国IKA公司)；移液器(德国Brand公司)；PURELAB Chorusl Complete 超纯水机(英国ELGA公司)；LT-ET氮吹仪(北京LabTech公司)；TGL 1650高速离心机(湖南沪康离心机有限公司)；SB-800DTD超声波清洗机(宁波新芝生物科技股份有限公司).

丙酮(色谱纯，美国Fisher公司)；乙腈(HPLC，德国Merck公司)；冰乙酸与氯化钠(优级纯，国药集团化学试剂有限公司)；无水硫酸镁与醋酸钠(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙二胺-N丙基硅烷(PSA)、石墨化碳(GCB)与十八烷基硅烷(C18)(美国Agilent公司).

马拉硫磷、特丁硫磷、治螟磷、水胺硫磷、三唑磷和乙拌磷(质量浓度均为 100 μg/mL，天津农业部环境保护科研监测所)；喹硫磷、皮蝇硫磷和溴硫磷(质量浓度均为 100 μg/mL，坛墨质检-国家标准物质中心).

1.2 实验方法

1.2.1 标准溶液配制

单一农药标准品溶液：分别移取 1.0 mL 农药标准品，于 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成质量浓度为 10 μg/mL 单一农药标准品溶液，避光保存于 -4 ℃ 冰箱中.

混合农药标准品溶液：分别取 1 mL，10 μg/mL 单一农药标准品溶液，于 10 mL 容量瓶中，用丙酮定容至刻度，配成质量浓度为 1 μg/mL 混合农药标准品溶液，避光保存于 -4 ℃ 冰箱中.

西红花基质匹配标准工作液(现用现配)：取混合农药标准品溶液，用西红花空白样液稀释成2.0、4.0、6.0、40.0、60.0、100.0 μg/kg，体积为 1 mL 的基质匹配标准工作液.

丙酮溶剂标准工作液：除用丙酮稀释外，其余操作同西红花基质匹配标准工作液的配制.

1.2.2 气相色谱-质谱条件

色谱柱：HP-5 ms UI毛细管柱(30 m×0.25 mm×0.25 μm)；载气为He(纯度≥99.999%)、流速为 1.0 mL/min；进样口温度 280 ℃；进样体积 1 μL；不分流进样；升温程序：50 ℃(保持 1 min)，先以 30 ℃/min 升至 130 ℃，再以 5 ℃/min 升至 245 ℃(保持 2 min).EI离子源；电子能量 70 eV；离子源温度 300 ℃；传输线温度 280 ℃；溶剂延迟 8.0 min；监测模式为MRM.

1.2.3 样品前处理

将西红花样品粉碎成粉末，称取 2 g(精确到 0.000 1 g)于 50 mL 聚苯乙烯具塞离心管中，加入 10 mL 含1% HAc的CH3CN溶液，涡旋混匀 30 s.离心管置于冰浴中，加入 1.0 g NaAc、4.0 g 无水MgSO4、0.5 g 无水NaCl及1颗陶瓷均质子，盖好管盖，超声提取 5 min 后，以 8 000 r/min 离心 5 min.向预先装有 50 mg PSA、 25 mg C18、25 mg GCB和 150 mg MgSO4的 5 mL 聚苯乙烯离心管中加入 1.0 mL 上清液，盖好管盖，振荡 30 s，以 10 000 r/min 离心 5 min，上清液经氮吹浓缩至近干后用丙酮定容至 1 mL，经 0.22 μm 有机系滤头过滤，待测.

2 结果与讨论

2.1 质谱条件优化

正离子模式下，对混合农药标准品溶液在m/z50～410的范围内进行全扫描，获得总离子流色谱图，结合NIST标准库检索，确定各农药的保留时间与母离子.再使用子离子扫描方式得到子离子，选取丰度较高、干扰较小的2对特征离子(其中丰度较高的一对为定量离子，另一对为定性离子).在2～40 eV碰撞电压范围内，利用仪器软件“设计实验助手”优化离子对的碰撞能量，利用仪器软件“分析实验助手”确定离子对的最佳碰撞能量，建立优化的MRM方法.经优化MRM方法测得农药的保留时间、定性离子对、定量离子对与碰撞能量结果见表1，混合农药标准品(0.15 μg/mL)的MRM色谱图见图1.

表1 有机磷农药保留时间、定量离子对、定性离子对、碰撞能量、校准曲线、相关系数(r2)、检出限、定量限及基质效应

续表1

图1 西红花基质中9种有机磷农药混标MRM色谱图

2.2 提取溶剂优化

对提取溶剂的种类进行优化，比较了正己烷、丙酮、乙腈和1%HAc-乙腈的提取效果.结果表明：正己烷易挥发且极性较弱，对极性较大农药的提取效果不佳；丙酮提取液中色素等杂质含量较多，净化效果差.与其它溶剂相比，乙腈用作提取剂可以更好地避免脂类、蛋白质以及其它成分的干扰、回收率更高、重复性更好[6].基于此，乙腈成为传统QuEChERS法的提取剂，但用纯乙腈对碱敏感的农药提取时，回收率不令人满意.使用1%HAc溶液适当地改变乙腈的酸度，能将对碱敏感农药的回收率提高至满意的程度.因此，采用1%HAc-乙腈溶液作为提取液，同时用NaAc与HAc配成缓冲溶液以保持pH值为6～7[7].

2.3 超声提取时间优化

为除去样品中的水分加入无水MgSO4，为增强盐析作用加入NaCl.在西红花样品中加入1%HAc-乙腈溶液、NaCl及无水MgSO4后，考察不同的超声提取时间(3、5、15、25、35 min)对提取效果的影响.结果表明：超声提取时间对提取效果影响不明显，为了提高效率，选择超声提取时间为 5 min.

2.4 吸附剂选择

西红花含有色素、糖类、脂肪酸和黄酮类等复杂成分，用单一吸附剂净化效果不太明显.

无水MgSO4能吸附溶液中残留的水分同时降低乙腈萃取物的极性并使某些极性基质共萃取物沉淀[8].在 50 mg PSA、 25 mg C18、25 mg GCB与 40.0 μg/kg 农药添加水平下，考察75、150、225、300 mg 无水MgSO4对农药回收率影响.结果表明：当无水MgSO4用量大于 150 mg 时，回收率在70%～110%间的农药种类不再变化，综合考虑添加 150 mg 无水MgSO4.

PSA是一种弱阴离子交换剂，能去除有机酸、糖类以及其它能形成氢键的成分[6,9].在 150 mg 无水MgSO4、25 mg C18、25 mg GCB与 40.0 μg/kg 农药添加水平下，考察50、100、150、200 mg PSA对农药回收率的影响.结果表明：当PSA用量为 50 mg 时，所有农药的回收率均达到70%以上，随PSA用量增加，水胺硫磷回收率下降.可能因为PSA用量导致提取液呈碱性，水胺硫磷在碱性环境下不稳定分解.基于此，添加 50 mg PSA.

C18在去除油脂和非极性干扰物方面效果良好[10].在 150 mg 无水MgSO4、50 mg PSA、25 mg GCB与 40.0 μg/kg 农药添加水平下，考察25、50、75、100 mg C18对农药回收率的影响.结果表明：C18用量对回收率影响不明显，为节约成本，添加 25 mg C18.

GCB能除去色素特别是叶绿素但需注意的是其能吸附具有平面结构的农药而导致回收率降低[11].在 150 mg 无水MgSO4、50 mg PSA、 25 mg C18与 40.0 μg/kg 农药添加水平下，考察15、25、35、45 mg GCB对农药回收率的影响.结果表明：随GCB用量增加，提取液褪色更明显，但皮蝇硫磷、水胺硫磷、溴硫磷、喹硫磷与三唑磷的回收率降低明显.综合考虑回收率与提取液净化效果，添加 25 mg GCB.

通过实验优化，选择 50 mg PSA、25 mg GCB、25 mg C18与 150 mg MgSO4为吸附剂，可以获得较好的净化效果.

2.5 线性范围、检出限与定量限

在优化的气相色谱-质谱条件下，对西红花基质匹配标准工作液测定，以各农药浓度作为横坐标，定量离子对峰面积作为纵坐标，绘制标准曲线.结果表明：在2.0～100.0 μg/kg 范围内，9种农药线性关系良好，相关系数(r2)≥0.999 6.以信噪比S/N≥3确定检出限(limit of detection, LOD)，9种农药的LOD为0.5～1.3 μg/kg，相同农药的LOD值低于《中国药典》2015版通则2341第四法中的LOD值.以信噪比S/N≥10确定定量限(limit of quantification, LOQ)，LOQ为2.0～3.2 μg/kg，结果见表1.

2.6 基质效应

质谱分析中，由于基质效应的存在，会对定量分析结果的准确性和重复性造成影响[12].基质效应相对强度(matrix effect, ME,%)=[(基质匹配校准曲线的斜率/溶剂校准曲线的斜率)-1]×100[13]，ME<-50%或者ME>+50%为强基质效应；-20%

2.7 回收率与精密度

在2 g西红花空白样品中，添加水平为4.0、40.0、100.0 μg/kg 的农药混标进行加标回收率实验，每一添加水平测定6次，方法的准确度以加标回收率表示，方法的精密度以相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)表示.农药的平均加标回收率分别为73.2%～81.1%、81.4%～84.4%和98.9%～103.9%，RSD分别为1.5%～6.1%、0.71%～4.0%和0.64%～1.8%，结果见表2.结果表明：该法的准确度和精密度较好.

表2 西红花基质中9种有机磷农药加标回收率及相对标准偏差(n=6) %

2.8 实际样品测定

对从云南省大理市药材市场购买的西红花样品15批应用建立的方法进行分析，在1批样品中检出特丁硫磷，含量为 35.2 μg/kg.

3 结语

本研究改进了QuEChERS样品前处理方法，以GC-MS/MS采取MRM模式分析，建立了西红花中9种有机磷农药残留的分析方法.与《中国药典》2015版通则2341第四法相比，本方法优势明显：1)方法的LOD值为0.5～1.3 μg/kg，相同农药的LOD值低于药典方法，方法的LOQ值为2.0～3.2 μg/kg，能完全满足西红花限量分析的要求；2)试剂用量少，前处理效率高，节约成本.西红花成分复杂，基质效应明显，为提高定量分析的准确性，采取基质匹配标准工作液校正.本研究建立的方法具有简单、快捷、成本低、准确度和灵敏度高等优点，适用于西红花中有机磷农药多残留的检测.