林继辉，赖俊杰，刘蒙佳

(福建师范大学 闽南科技学院，福建 南安 263223)

杏鲍菇含有较高的蛋白质和较低的脂肪以及人体所需的各种不同的氨基酸[1-3]，同时它也是一种含有较多三萜类化合物的菌类.而且在食用菌中三萜化合物里所含的三萜烯和三萜皂苷含量比较丰富.三萜化合物主要存在形式是游离形式或者与糖结合成苷或成酯.经过大量实验得出三萜化合物具有以下这些作用：可以降低人体中的血脂含量、降低胆固醇的含量、抗肿瘤、润肠道、增强免疫力、美容以及防止心血管病等药效[4].但很少有关于优质品种的选育、高产量栽培以及商品化杏鲍菇中三萜化合物的提取工艺研究及其优化的报道[5-7].

目前国内外三萜化合物的提取方法有：碱水提取法，其缺点是提取效率低；索氏提取法，其缺点是仅限于实验室研究，不适合规模化；有机溶剂提取法，其缺点是受热时间长比较不稳定，但是它的优点也很多，所需的提取周期短、提取温度低、溶出率高、适应性广、操作比较容易等[8-9].本实验采用的是以乙醇溶液为提取剂的有机溶剂提取法，再利用响应面分析法[10]确定杏鲍菇中三萜化合物的最佳提取工艺条件.由于该方法操作简单，耗费的时间也较少，能够为深度开发和规模化提取杏鲍菇三萜化合物提供技术支持和理论基础.

1 实验设计

1.1 主要仪器与试剂

JP-150A型高速多功能粉碎机，永康市久品工贸有限公司；KQ5200B型超声波清洗机，昆山市超声仪器有限公司；721-VIS型紫外可见分光光度计，上海佑科仪器仪表厂；

纯度为99%香草醛、98%齐墩果酸标准品；无水乙醇、冰醋酸、高氯酸等均为分析纯.

1.2 材料与实验方法

1.2.1 材料准备

准备实验所需要的新鲜杏鲍菇，将其清洗干净，用水果刀将其切成薄片后，放在 50 ℃ 烘箱里恒温烘干.再将烘干后的杏鲍菇放进粉碎机里粉碎至粉末，最后用规格为 0.301 mm 的筛网筛选，将过筛后的这些粉末装进规格为 250 mL 的光口试剂瓶中进行密封保存，以备后续实验所用[9].

1.2.2 三萜化合物的提取

准确称取 2.0 g 的杏鲍菇粉末于锥形瓶中，按照一定的料液比加入乙醇水溶液，搅拌至均匀.再将其放在超声设备中，在一定温度下超声处理，取出后抽滤. 5 000 r/min 离心 5 min ,取上清液.

1.2.3 齐墩果酸标准曲线的绘制

准确称取齐墩果酸标准品 5.0 mg 于烧杯中，倒入适量的无水乙醇溶液使其充分溶解后移入规格为 50 mL 容量瓶中，再用无水乙醇定容至刻度线.依次用移液管量取标准溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 mL 于8支比色管中，另取1支加入 1 mL 无水乙醇的空白对照比色管，然后将9支管置于热水中挥去溶剂后，用移液管移取 0.4 mL 新制的5%冰醋酸-香草醛和 1 mL 的高氯酸于上述9支管内，快速震荡混匀.再将其放入提前设定好的温度为 60 ℃ 的恒温水浴锅中，计时加热 15 min.最后，利用夹子将其逐个取出后，冷却至室温.再往其内加冰醋酸定容至 5 mL 刻度线处，迅速混匀溶液.取适量的溶液小心倒入比色皿中，然后利用紫外分光光度计在波长 545 nm 处测定吸光值.利用origin制图软件绘制出以横坐标为齐墩果酸的质量浓度(μg/mL)和纵坐标为吸光值(A)的标准曲线图[11].

1.2.4 三萜化合物的测定

采用5%香草醛-冰醋酸溶液显色比色法[12]测定三萜化合物.其原理是因为三萜化合物中的羟基在高氯酸的作用下脱水与香草醛结构中的醛基发生缩合反应产生双键结构，并在冰醋酸的作用下生成碳正离子盐紫色物质.用移液管准确移取 0.2 mL 上清液、0.4 mL 新制的5%冰醋酸-香草醛，再小心移取 1.0 mL 高氯酸(避免灼伤)于烧杯中，并将其快速震荡混匀.将混合液置于 60 ℃ 的恒温水浴中，加热 15 min.最后，利用夹子将烧杯取出后，放在装有冷水的水箱中，将溶液冷却至 25 ℃.加入冰醋酸定容至刻度线为 5 mL 处，迅速混匀溶液.取适量的溶液小心倒入比色皿中避免手被灼伤，然后在波长 545 nm 处，利用紫外可见分光光度计测定其吸光度[13],后代入齐墩果酸的标准曲线方程中计算得出三萜化合物的质量浓度ρ.并按照式子(1)进行计算提取率(Y).

(1)

其中，V为提取液体积(mL)；ρ为齐墩果酸的质量浓度(μg/mL)；M为样品的质量(g).

1.2.5 单因素实验设计

1) 乙醇体积分数对三萜化合物提取得率的影响 准确称取 2.0 g 的杏鲍菇粉末5份倒入5个规格为 250 mL 的锥形瓶中，按料液比为1∶25(g/mL)加入乙醇溶液然后放入温度为 55 ℃ 的超声波清洗机中进行超声 30 min，考察体积分数为65%、70%、75%、80%、85%的乙醇溶液，对三萜化合物提取率的影响，以确定最佳乙醇浓度.

2) 超声时间对三萜化合物提取率的影响 准确称取 2.0 g 的杏鲍菇粉末5份倒入5个规格为 250 mL 的锥形瓶中，按料液比为1∶25(g/mL)加入75%乙醇溶液然后放入温度为 55 ℃ 的超声波清洗机中进行超声，考察提取时间分别为：15、20、25、30、35 min 对三萜化合物提取率的影响，以确定最佳超声提取时间.

3) 提取温度对三萜化合物提取率的影响 准确称取 2.0 g 的杏鲍菇粉末5份倒入5个规格为 250 mL 的锥形瓶中，按料液比为1∶25(g/mL)加入75%乙醇溶液然后放入超声波清洗机中超声 25 min，考察提取温度为：25、35、45、55、65 ℃ 对三萜化合物提取率的影响，以确定最佳超声提取温度.

4) 料液比对三萜化合物提取率的影响 准确称取 2.0 g 的杏鲍菇粉末5份倒入5个规格为 250 mL 的锥形瓶中，加入75%乙醇溶液，在提取温度为 55 ℃ 超声波清洗机中超声 25 min，考察料液比分别为： 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25(g/mL)，对三萜化合物提取率的影响，以确定最佳料液比.

1.2.6 响应面设计

采用Box-Behnken中心组合原理，对以上单因素进行四因素三水平的试验设计[14-16].编码情况如表1所示.

表1 响应面设计编码表

1.2.7 数据处理

采用origin8.0软件进行绘图，采用Design-Expert8.0.5b响应面软件对实验进行设计和数据方差分析.

2 结果与分析

2.1 齐墩果酸标准曲线的绘制

按照步骤2.2.3齐墩果酸标准曲线的制作方法，将不同溶度所对应的吸光度输出绘图软件得出吸光值(y)与齐墩果酸质量浓度(x)的线性回归方程为：y=0.043 7x-0.005 4，R2=0.997 5.

2.2 单因素实验

2.2.1 乙醇体积分数对三萜化合物提取得率的影响

由图1可知，随着乙醇体积分数的逐渐升高三萜化合物提取得率呈现先升高后降低的趋势.当乙醇溶液体积分数在65%～75%的时候，三萜化合物提取得率随乙醇体积分数浓度升高而增大，其原因是齐墩果酸三萜化合物是属于不溶于水的物质，但是在于醇、乙酸乙酯和丙酮等有机溶液中却极易溶解[17-18].所以只要在适当的乙醇体积分数条件下是可以增加其提取率的.但是当乙醇体积分数在75%～85%时，三萜化合物提取率却因乙醇体积分数的逐渐升高而显现出慢慢降低的趋势，原因是当乙醇体积分数达到一定百分比时，细胞内的蛋白质会发生变性凝固的现象，从而形成一定的传质阻力为提取增加难度，导致三萜化合物提取率下降，所以综合考虑最佳提取的乙醇溶液体积分数为75%.

图1 乙醇体积分数对三萜化合物提取率的影响

2.2.2 超声时间对三萜化合物提取率的影响

由图2可知，当超声时间在15～25min的时候，三萜化合物的提取率呈现连续升高趋势，这是由于随着超声时间的延长，物料与溶剂的混合程度会越来越充分，同时在超声波的协助下有利于细胞内部的三萜化合物的溶出，所以提取率逐渐升高.当超声时间在25～35 min 时，随着超声时间的增加提取率却越来越低，原因来自两方面，其一是因为超声时间的延长会使物料中含有其他溶于醇的成分慢慢溶出，从而会与三萜化合物形成溶剂竞争关系，与此同时可能也增加了其他杂质，不利于提取[17]；其二是随着超声时间的延长，带来强的机械振动可能会破坏溶出的三萜化合物，进而使提取率下降.所以，三萜化合物的提取时间选取在 25 min 时为宜.

图2 超声时间对三萜化合物提取率的影响

2.2.3 提取温度对三萜化合物提取率的影响

由图3可知，当提取温度在25～45 ℃ 之间时，三萜化合物提取率的增长速度为先慢后快，这是因为温度的逐渐升高会增加物料中三萜化合物的溶出，从而有利于提取.但在提取温度为45～65 ℃ 时，温度的不断升高使三萜化合物提取率下降，是因为温度的升高加快了溶剂的挥发速度，再加上其它物质的溶出从而影响后续的提取.所以，确定最佳提取温度为 45 ℃.

图3 提取温度对三萜化合物提取率的影响

2.2.4 料液比对三萜化合物提取率的影响

由图4可知，当物料与乙醇溶液比例(g/mL)在1∶5～1∶20之间时，随着料液比比值的升高三萜化合物提取率也随之上升，这是因为随着乙醇溶液的增加使物料与溶剂接触碰撞的概率增加，有利于三萜化合物的溶出，使得提取率随料液比的增加而上升；后面出现提取率下降，这主要是由于物料中的提取物含量有限，即使溶剂继续增加时对提取率的影响不大，反而使其他物质溶出而降低其提取率.所以确定提取的最佳料液比为1∶20(g/mL).

图4 料液比对三萜化合物提取率的影响

2.3 响应面实验结果及分析

2.3.1 响应面实验结果

利用超声波提取杏鲍菇中三萜化合物，对单因素实验的结果通过Box-Behnken实验设计优化三萜化合物提取工艺参数，响应面实验结果见表2.

表2 响应面实验结果

续表

标号因素ABCD得率/(μg·g-1)22000027925100-125026-1010243270110271280-1-10165291001261

2.3.2 模型的建立及显著性分析

利用Design-Expert 8.0.5b软件，对上表中的数据进行二次多元回归拟合处理，得出提取率Y=287.80+5.08×A+46.83×B-9.58×C-0.67×D+1.00×AB+0.50×AC+0.75×AD+1.0×BC-2.0×BD-15.75×CD-15.36×A2-50.23×B2-24.11×C2-25.73×D2的回归方程.

对该方程的有效性进行检测，利用响应面软件对模型的方差进行分析.

由表3方差分析表可知，该实验中方差来源：A2的(P<0.05)表示影响显著，B，B2，C2，D2的(P<0.01)表示影响极显著.再通过F值的大小比较，从而可以得出各因素对三萜化合物的主次关系为：B(料液比)>C(超声时间)>A(乙醇体积分数)>D(提取温度).

表3 方差分析表

在验证模型有效性时，对应的P值是要小于 0.000 1 的，由表3可以清楚地看出，试验所得的回归模型的P值满足该条件，说明回归效果极显著，所以足以证明其有效性.同时，该模型的私差拟合项(P>0.05)也可以进一步说明模型的拟合度不错.进而表明三萜化合物提取率的预测值与实验值之间具有良好的一致性.

2.3.3 因素间的交互作用

响应面图不仅可以反映提取率的影响因素，还可以体现两因素之间的交互作用[19-20].通过观察响应面可以判断出各因素影响的大小.等高线和响应面是辨别影响大小的2个重要因素，当前者密集，后者陡峭，则表示两因素之间的交互作用就较明显；反之，表示两因素之间的交互作用就较不明显.通过利用上述回归方程做出响应面，从而可以更清楚地分析出4个不同因素对杏鲍菇三萜化合物提取率的影响.

由图5可以看出，提取率呈先增大后减小的趋势.同样，图8、图9两因素间也呈类似的趋势，虽然提取率有最大值，但是因素与因素之间的交互作用不明显.再由图6可以看出，当乙醇体积分数一定时，随着超声时间逐渐延长三萜化合物的提取率呈现先增大后减小的趋势.同样，超声时间不变时，随着乙醇体积分数百分比的不断增大三萜化合物的提取率也呈相似趋势.说明这种情况下三萜化合物的提取率有最大值，而且因素与因素之间的交互作用明显.同理，图7、图10也呈此趋势，因此也具有以上特点.

图5 料液比和乙醇体积分数的交互作用 图6 超声时间和乙醇体积分数的交互作用

图7 提取温度和乙醇体积分数的交互作用 图8 超声时间和液料比的交互作用

图9 液料比和提取温度的交互作用 图10 提取温度和超声时间的交互作用

2.3.4 最佳工艺条件的验证

为了验证模型的可靠性，对所得的最佳工艺流程进行了实际试验.由 Design expert10 软件对试验结果数据进行分析得出最优工艺为：乙醇体积分数76.099%、时间 25.692 min、提取温度 42.465 ℃、料液比 1∶22.928,模型预测三萜化合物提取得率为 296.1 μg/g；考虑到实验的实际可操作性将模型的预测的最优工艺微调整为：乙醇体积分数76.0%、时间 25.7 min、提取温度 42.5 ℃、料液比 1∶23.0，按照提取方法在此条件进行3次平行实验，获得最优工艺条件下三萜化合物提取平均得率为 287 μg/g，两者之间的相对误差为3.07%，小于5%，说明该模型具有一定的可靠性.

3 结语

超声波提取杏鲍菇三萜化合物的最佳工艺条件为：使用76.0%乙醇溶液、物料与乙醇溶液比例1∶23.0(g/mL)，在42.5 ℃条件下超声提取 25.7 min.在此条件下，杏鲍菇三萜化合物提取率可达 287.0 μg/g，模型预测值为 296.1 μg/g，两者之间的相对误差为3.07%，小于5%，说明该模型具有一定的可靠性.实验中使用的方法操作简便，且对提取温度要求较低，提取效率也相对较高.因此，对于杏鲍菇三萜化合物的提取可以提供参考.