刘 娜，夏咸松，赵 毅，苏刘艳，孙金瑞

(云南中医药大学 中药学院，云南 昆明 650500)

草果(Amomumtsaoko)是姜科豆蔻属植物的干燥成熟果实，成熟时红色，种子呈多角形，香味浓郁；其果实能入药，味辛、性温，入脾、胃二经，燥湿温中，除痰截疟；主治脘腹胀满，反胃呕吐，食积疟疾等症[1-3].草果作为调味香料在我国云南、广西、四川和贵州等地均有种植，作为经济作物且属于药食同源的中药材，其发展越来越受到云南省多个地区的重视[4-6]，但是目前90%以上的草果用于食品添加[7-8]，只有不到5%的产量应用于中成药的调配和其它领域[9-10]，药用价值亟待开发.

本文对4个不同产地的草果挥发油的成分进行了对比分析，同时研究了不同产地草果挥发油的100%提取液对白色念珠菌标准株SC5314、白色念珠菌临床分离耐药株23#、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌的抑菌效果.

1 实验仪器与试剂

1.1 仪器

电子天平CP114(奥豪斯仪器上海有限公司)；SG8200HPT型超声波清洗器(上海冠特超声仪器有限公司)；SHZ-CBZ型循环水式多用真空泵(巩义市予华仪器有限公司)；低温冷却液循环泵DLSB-20L/30(巩义市予华仪器有限责任公司)；101-4AS电热鼓风干燥箱(北京市永光明医疗仪器厂)；FA2104分析天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司)；HP6890GC/5973MS气相色谱-质谱联用仪(美国Agilent Technologies公司).

1.2 试剂

草果 产地1：怒江草果；产地2：保山草果；产地3：越南草果；产地4：绿春草果(经云南中医药大学鉴定教研室杨雅竹副教授鉴定为姜科豆蔻属植物草果Amomum tsaoko的干燥成熟果实)；正己烷(分析纯，广东光华科技股份有限公司，20181221)；氟康唑分散片(南昌弘益药业有限公司，181001)；DMSO(BioFRoxx，EZ2921C395)；沙氏液体培养基(广东环凯微生物科技有限公司，1076161)；沙氏固体培养基(广东环凯微生物科技有限公司，1076641)；亚甲蓝M-H琼脂培养基(广东环凯微生物科技有限公司，1081661)；LB固体培养基(Solarbio，20190529)；琼脂(Agar，BioFRoxx，EZ1609C222)；氯化钠(分析纯，天津风船化学试剂科技有限公司，20181203).

1.3 培养基和菌株

抗真菌活性检测阳性对照药物氟康唑溶于DMSO，离心后取上层清液，贮存浓度为 50 mg/mL，4 ℃ 密封避光保存.

1.3.1 培养基

1) 沙氏液体培养基 蛋白胨 10.0 g、葡萄糖 40.0 g 溶解于 1 000 mL 蒸馏水中， 115 ℃ 高压灭菌30 min，备用.

2) 沙氏固体培养基 蛋白胨 10.0 g、葡萄糖 40.0 g、琼脂 20 g 溶解于 1 000 mL 蒸馏水中，115 ℃ 高压灭菌30 min，备用.

3) 亚甲蓝M-H琼脂培养基 M-H琼脂+2%葡萄糖 +0.5 μg/mL 亚甲蓝，121 ℃ 高压灭菌 15 min，备用.

4) LB液体培养基 精密称取胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化钠 10 g，置于 1 000 mL 蓝盖试剂瓶中，并用蒸馏水定容到 1 000 mL,121 ℃ 高压灭菌 15 min，备用.

5) LB固体培养基 精密称取胰蛋白胨 10 g、酵母提取物 5 g、氯化钠 10 g，琼脂 15 g，置于 1 000 mL 蓝盖试剂瓶中，并用蒸馏水定容到 1 000 mL，121 ℃ 高压灭菌 15 min，备用.

1.3.2 菌株

白色念珠菌标准株SC5314、白色念珠菌临床分离耐药株23#(昆明医科大学第一附属医院李玉叶惠赠)、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌.

2 方法与结果

2.1 草果挥发油得率

2.1.1 挥发油的提取

采用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油.称取约 1.5 kg 草果药材粗粉，投于 10 000 mL 圆底烧瓶中，加入6倍水量及沸石数颗，摇匀后置于电热套中，连接挥发油提取器与球形冷凝管，参照2015版《中国药典》四部通则2204挥发油测定法-甲法[12]，浸泡 8 h 后加热至沸腾，并保持微沸 8 h，至挥发油提取器中不再有挥发油馏出，分离挥发油经测量出油量后冷冻保存.

精密量取挥发油 0.5 mL，至 10 mL 量瓶，加正己烷，定容，混匀，过 0.45 μm 微孔滤膜，进行GC- MS分析.

2.1.2 草果挥发油得率的计算

称取约 1.5 kg 草果药材粉末，用水蒸气蒸馏法提取草果挥发油，按下述公式计算挥发油得率，结果见表1.

挥发油得率(mL/kg)=挥发油体积(mL)/草果粗粉重量(kg).

2.1.3 结果

根据挥发油量和草果重量计算出4个产地草果的挥发油得率.如表1所示，不同产地的草果，挥发油得率不同.4个地区草果按照不同挥发油得率从大到小依次为：怒江草果、保山草果、越南草果、绿春草果；其中挥发油得率最高的是怒江草果达到了 20.67 mL/kg，最低的是绿春草果为 13.73 mL/kg.

表1 各产地草果挥发油提取率表

2.2 草果挥发油成分分析

2.2.1 气相色谱-质谱条件

GC条件：HP-5MS石英毛细管柱(30 mm×0.25 mm×0.25 mm)；柱温：起始温度 40 ℃，程序升温 3 ℃/min 至 80 ℃，再 5 ℃/min 升温至 280 ℃，保持 5 min；柱流量为 1.0 mL/min；进样口温度 250 ℃；柱前压 100 kPa；进样量 1.0 mL；分流比 10∶1;载气为高纯氦气.

MS条件：电离方式EI；电子能量70；传输线温度 250 ℃；离子源温度 230 ℃；四极杆温度 150 ℃；质量范围35～500；采用wiley7n.l标准谱库计算机检索定性.

2.2.2 总离子流图

采用 GC- MS 对草果挥发油化学成分进行了分析.在测试条件下对4个不同产地的草果挥发油进行 GC-MS 测试，测得上述4种挥发油的总离子流 (TIC) 如图 1～4 所示.经GC-MS 检测，对不同产地草果挥发油的GC-MS分离出90个化合物.将各组分质谱数据由 wiley7n.l标准谱库检索并结合有关参考文献等，鉴定了其中73个化合物，用峰面积归一化法计算各成分在挥发油的相对百分含量见表2.

图1 怒江草果挥发油总离子流图 图2 保山草果挥发油总离子流图

图3 越南草果挥发油总离子流图 图4 绿春草果挥发油总离子流图

2.2.3 成分分析

根据保留时间(t)，4个不同产地的草果挥发油共分离出化合物90个，其中4个产地的草果挥发油分离出共有成分化合物52个；将各组分质谱数据由 wiley7n.l标准谱库检索，鉴定出化合物成分73个，不同产地草果挥发油的GC-MS数据分析见表2.

表2 不同产地草果挥发油的GC-MS数据表

续表2

续表2

从表2 可知，4个不同产地草果挥发油鉴定出共有成分52个化合物，其中主要成分为烯烃类、醇类、醛类、酯类、其它(苯硼酸乙二醇酯、1,3-环己二烯、2-甲基-5-(1-甲基乙基)-单环氧化合物、1,2-二氢-5,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶碳腈等).

4个产地的草果挥发油中含量较高的共有已知组分经统计为12个化合物，分别是：α-蒎烯、2-β-蒎烯、α-水芹烯、1,8-桉叶油素、2-辛烯醛、芳樟醇、4-松油醇、α-松油醇、Z-柠檬醛、1,2-二氢-5,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶碳腈、E-5-十二烯-1-醇醋酸酯、反-橙花叔醇；这12个共有成分占挥发油总含量的60%以上(分别占总挥发油的65.79%；64.99%；62.88%；67.28%).1,8-桉叶油素和α-水芹烯最主要成分，其中1,8-桉叶油素(含量分别为36.63%、38.17%、37.11%、39.12%)，差异不大.

表3 不同产地草果挥发油中含量较高的12个共有成分的GC-MS成分分析表

上述结果表明，草果挥发油的成分与生产地生态、品种有关，但主要的共有成分差异不大.

2.3 抑菌试验

2.3.1 抑菌试验实验方法K-B法(标准滤纸片法)

取培养基上 37 ℃ 培养16～18 h 的纯菌落，制备菌悬液，调整浓度为1×107 CFU/mL，每个平板各加载菌液 500 μL，立即用棉拭子均匀涂板，放置10 min左右，待菌液完全被平板吸收，用镊子加载直径为 6 mm 的无菌滤纸片.

加载纸片后，取一定量的100%挥发油加载在滤纸片的正中心，防止抑菌圈畸形，待样品均匀、完全的吸收后，放入恒温恒湿箱或CO2培养箱中，一般情况下，孵育18～24 h(真菌)或12～16 h(细菌)后，检查每一块平板，若接种平板满意，抑菌圈应为正圆形，菌落应相互融合生长.测量抑菌环的直径边缘为80%被抑制即可，如果菌落生长较弱，应该继续培养20～24 h.

在不反光的黑色背景下读取抑菌圈的直径，抑菌圈的直径包括纸片的直径.抑菌圈的界限应该是以肉眼观察没有明显可见真菌生长的区域，在抑菌圈边缘微弱生长的、仅能在放大镜下观察到的细小菌落应忽略.

2.3.2 挥发油抑菌活性实验结果

4个不同产地草果挥发油抑菌活性实验结果见表4，草果挥发油对白色念珠菌标准株SC5314抑菌圈的直径都已经超过整个培养皿(>40 mm)，整个培养皿不长菌，有很好的抑菌效果，抑菌效果明显优于氟康唑的抑菌效果.对白色念珠菌临床耐药株23#产地1与产地2挥发油的抑菌圈直径都已经超过整个培养皿(>40 mm)有很好的抑菌效果，产地3与4挥发油抑菌圈的直径分别为20、22 mm，其抑菌效果也明显优于氟康唑.对金黄色葡萄球菌草果挥发油呈现出较好抑菌效果，抑菌圈的直径对应产地1、产地2、产地3、产地4分别为：18、7、14、13 mm.相对而言，草果挥发油对大肠杆菌抑菌效果没有比较优势，但是仍显现出抑菌效果.

表4 不同产地草果挥发油抑菌活性实验汇总表 mm

3 讨论与结语

采用水蒸汽蒸馏法提取草果挥发油，4个产地的草果挥发油得率不同，其中怒江草果挥发油产率最高，为 20.67 mL/kg；上述4个产地均为低纬度高海拔地区，而怒江产草果挥发油产率最高可能与当地地质有关.

4个产地的草果挥发油中共有12个相同的已知组分分别是：α-蒎烯，2-β-蒎烯，α-水芹烯，1,8-桉叶油素，2-辛烯醛，芳樟醇，4-松油醇，α-松油醇，Z-柠檬醛，1,2-二氢-5,6-二甲基-2-氧代-3-吡啶碳腈，E-5-十二烯-1-醇醋酸酯，反-橙花叔醇.4个产地草果挥发油中含量最高的主要成分为1,8-桉叶油素占总挥发油的百分比分别为(36.63%；38.17%；37.11%；39.12%)，4个产地中草果挥发油12个共同组分占总挥发油的百分比分别为：产地1占65.79%；产地2占64.99%；产地3占62.88%；产地4占67.28%.产地不同，挥发油成分和比例均有差异，有待进一步鉴定分析.

4个不同产地草果挥发油抑菌效果为白色念珠菌标准株SC5314>白色念珠菌临床耐药株23#>金黄色葡萄球菌>大肠杆菌，对白色念珠菌的抑菌效果具有显著优势，这可能与挥发油的组份存在差异有关.

本文以怒江、保山、越南、绿春等4地产草果的挥发油为研究对象，对其中的主要成分的含量进行了对比，并围绕常见的4种致病菌进行了抑菌试验，为后期草果挥发油的质量标准制定提供了相关的数据支撑，彰显了草果挥发油在抑菌方面价值，为草果的综合开发提供理论依据同时为课题组后期重点研究怒江草果奠定了基础.