马雪妮 许慧梅 程 龙 杨一蕃 张德奎

（兰州大学第二医院消化内科，兰州 730030）

炎症性肠病（inflammatory bowel disease，IBD）是常见的慢性、反复发作性、非特异性胃肠道自身炎症性疾病，主要包括克罗恩病（Crohn's disease，CD）和溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）［1］。已有的证据表明，基因、环境、免疫等多种因素共同参与IBD 的发病［2-3］。IBD 的主要病理变化是异常的黏膜免疫和炎症反应，其主要特点包括促炎症细胞因子、氧自由基、氮的生成及炎症细胞的激活。其中，中性粒细胞是参与组织炎症损伤的主要细胞，其在IBD 中的主要机制涉及迁移并聚集在炎症部位，并释放炎症因子及大量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）［4-5］。

近年来，国内外学者研究表明：作为一种有别于细胞坏死和凋亡的特殊细胞死亡程序，中性粒细胞外诱捕网（neutrophil extracellular traps，NETs）与许多自身免疫/炎症性疾病［系统性红斑狼疮（SLE）、类风湿关节炎、银屑病、痛风及小血管炎等］、肿瘤性疾病（肺癌、乳腺癌及结直肠癌等）、创伤愈合（糖尿病患者创伤愈合）、感染性疾病（败血症及脓毒症等）、血栓性疾病（下肢深静脉血栓、冠状动脉粥样硬化性心脏病等）等密切相关［6-13］。而炎症性肠病作为胃肠道自身炎症性疾病，其具体发病机制尚未完全阐明。本文重点就NETs 与炎症性肠病关系的最新研究进展进行综述，旨在为炎症性肠病的发病机制和治疗方案提供新思路。

1 NETs概述

1996 年，TAKEI 等［7］使用氟波醇（phorbol myristate acetate，PMA）激活中性粒细胞时观察到，中性粒细胞的分叶核退缩、扩散，染色体解聚，核膜破裂，核内成分释放到细胞质，细胞膜破裂。同时，BRINKMANN 等［14］在2004 年将该过程中释放于细胞外的网状结构正式命名为NETs。随着后续研究的不断深入，NETs 被认为是以DNA 为骨架，其间镶嵌组蛋白、中性粒细胞弹性蛋白酶（neutrophil elastase，NE）、髓过氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）、钙卫蛋白、基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinases，MMP）、组织蛋白酶G 等颗粒蛋白、蛋白水解酶、抗菌肽及组蛋白等［15］。目前已发现，多种物质能诱导NETs 形成，包括细菌、真菌、原生动物、病毒等在内的病原体和一些化学或生物因素［7，16-19］。中性粒细胞产生NETs的过程被称为NETosis，目前研究发现，根据刺激物的不同，其主要涉及3种不同模式：①自杀式NETosis：又称晚期溶解性NETosis，此类NETs的产生起始于中性粒细胞受到PMA 等刺激后通过蛋白激酶C（PKC）激活Raf/MERK/ERK信号转导通路激活烟酰胺腺嘌呤二核苷磷酸（NADPH）氧化酶，进而刺激ROS 产生，从而组蛋白在肽酰基精氨酸脱亚胺酶4（peptidyl arginine deiminase 4，PAD4）的作用下向瓜氨酸化组蛋白转变，形成瓜氨酸化的组蛋白，其中瓜氨酸化的组蛋白H3（citH3）发挥了重要作用，并导致核染色体解聚［20］。该过程仅需2～4 h，并且与凋亡机制不同，其不需要半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶（cysteine-containing aspartate-specific proteases，Caspase）的参与。此过程主要依赖于ROS的产生及PAD4 介导的核染色体解聚［20］；②细胞核DNA 释放式NETosis：又称为早期非溶解性NETosis，Toll 样受体和补体C3 蛋白等可触发此种类型的NETosis，释放NETs 后的中性粒细胞寿命不受影响，且细胞核膜和细胞膜的完整性不被破坏，仍具有运动、趋化、吞噬病原体的能力，此过程约持续5～60 min［15］。但与自杀式NETosis 不同，该过程不依赖于ROS 的产生和Raf/MERK/ERK 信号通路的激活，然而该模式具体的发生机制尚不清楚［8］；③线粒体DNA 释放式NETosis：此类NETosis 同样依赖于ROS 的产生，主要由于中性粒细胞受到GM-CSF、C5a 或LPS 刺激，持续约15 min［15］。

2 NETs与IBD的关系

2.1 NETs 放大IBD 的炎症反应 IBD 主要表现为肠道黏膜慢性、反复发作性、非特异性炎症反应，研究发现：中性粒细胞的浸润与内镜下严重程度和全身炎症指数相关，而血清中C-反应蛋白的水平和粪便中的乳铁蛋白和钙卫蛋白可作为肠道炎症的敏感标志物，值得注意的是，乳铁蛋白和钙卫蛋白都是NETs的关键组成部分［21-23］。与之相似的是，2012年的一篇研究报道了在UC 患者的结肠组织中检测到穿透素3（PTX3）、MPO以及NE，三者均为NETs的组成部分［24］。虽然这些分子可以独立于NETs 分泌，但目前研究表明其在IBD炎症的发生发展过程中发挥重要作用。BENNIKE 等［11］采用蛋白质组学分析发现，在UC 患者组织标本中，有11种与中性粒细胞及NETs 有关的蛋白质水平升高，并且通过共聚焦显微镜观察在UC 患者的结肠组织标本中进行了验证。DINALLO 等［25］研究发现，与对照组相比，UC 患者结肠组织中PAD4 和citH3 的表达均增加。体外实验也表明，NETs 增加了UC 患者固有层单核细胞（LPMCs）炎症细胞因子（如IL-1β和TNF-α）的产生。可能的机制是NETs 能够增强UC 患者LPMCs 的ERK1/2的磷酸化，而选择性的ERK1/2抑制剂——PD98059 显著降低了NETs 诱导的促炎症细胞因子的产生。同时在体内实验中，用3.0%的葡聚糖硫酸钠溶液（dextran sulphate sodium，DSS）能够诱导BALB/c 小鼠产生NETs，主要表现为DSS 干预组小鼠结肠组织中PAD4 及citH3 的表达量明显高于对照组，同时，采用选择性PAD4 的抑制剂——链黑菌素能够有效地缓解DSS 诱导的炎症反应。此外，NETs 可引起巨噬细胞释放促炎症细胞因子，HU等［26］的研究结果揭示了NETs 作为损伤相关分子模式（damage-associated molecular patterns，DAMPs）的复合物（包含DNA、组蛋白和丝氨酸蛋白酶等），在LPS 存在的情况下通过Caspase-1 和Caspase-8 的作用诱导巨噬细胞样J774 细胞产生IL-1β，NET 相关的DNA 和丝氨酸蛋白酶参与了细胞产生IL-1β。而IL-1β 是一种典型的促炎症细胞因子，可刺激局部和全身炎症反应。最近的一项研究显示，NETs能显著增强单核细胞衍生的巨噬细胞对低剂量LPS的反应，并增加TNF-α、IL-6 和单核细胞趋化蛋白-1（monocyte chemotactic protein-1，MCP-1）的释放，而DNase 可显著降低该细胞的激活，同时，TNF-α、IL-6和MCP-1分泌量均减少［27］。因此，NETs可能通过附着于细胞外游离DNA（cell-free DNA，cf-DNA）骨架上的蛋白水解酶、颗粒蛋白及增强巨噬细胞产生促炎因子等作用放大了IBD的炎症反应。

2.2 NETs 加剧IBD 的组织损伤 肠道上皮细胞（intestinal epithelial cell，IEC）损伤导致肠上皮屏障功能受损是UC 的病理生理学表现之一，同时，血管内皮细胞（endothelium cell，EC）受损也会导致局部溃疡黏膜延迟愈合，加重肠道损伤。GOTTLIEB等［28］研究结果表明，无论是儿童UC 还是CD 患者，NETs的表达明显高于健康对照组。MARIN-ESTEBAN等［29］的研究结果显示，PLB-985 细胞系分化的中性粒细胞，在Escherichia coli诱导下产生的NETs 能够破坏人肠上皮样细胞Caco-2/TC7 细胞的F-肌动蛋白细胞骨架，可能的原因是镶嵌于游离DNA 骨架上的组蛋白、蛋白酶及ROS 介导的损伤作用。同时，部分研究指出作为NETs 的重要组成部分，包括蛋白酶3（proteinase 3，PR3）、MPO、NE、组蛋白和组织蛋白酶G等在内的中性粒细胞蛋白的抗中性粒细胞胞质自身抗体（anti-neutrophil cytoplasmic antibodies，ANCA），可作为IBD 诊断和预后的生物标志物［30］。这些分子在NETs 形成期间释放，该过程可能也是ANCA产生的重要原因。此外，体内实验发现：ANCA可诱导中性粒细胞形成NETs 并激活补体导致内皮损伤，暴露于NETs 的树突状细胞可诱导ANCA 产生，而在IBD 患者血清中也能检测到针对MPO 的ANCA。有趣的是，与CD 相比，针对PR3 的ANCA在溃疡性结肠炎患者的组织标本中更容易检测出来，从而可以区分两种疾病［31］。可能的原因是这两种疾病释放出的NETs 在组成成分上存在一定差异。同样，作为NETs的重要组成部分，NE的水平在IBD 患者粪便中升高，其破坏了上皮屏障功能，而抗弹性蛋白酶治疗能够改善小鼠实验性结肠炎。另一方面，近期有文献报道，NETs 分别通过组胺及PR3 介导了小血管炎和败血症中血管内皮功能损伤，而此作用在中性粒细胞和血管内皮细胞的体外共培养系统中得到验证［32］。另外，有研究指出，除了NETs 引起血管内皮细胞的损伤，促进肠道炎症和溃疡以外，受损的血管内皮还能转化为促凝表型，可能与活化的血小板共同作用，导致肠道外血栓的形成。而DNase 处理后，DSS 小鼠结肠炎肠道黏膜上皮细胞及血管内皮细胞死亡明显低于对照组［27］。因此，NETs可能通过破坏肠道黏膜上皮屏障功能及损伤血管内皮细胞促进IBD的发生发展。

2.3 NETs 促进IBD 的高凝状态 动静脉血栓栓塞是IBD 患者死亡的重要原因。近年来，NETs 与动静脉血栓的研究越来越多，研究表明：NETs 通过自身网状结构形成一个支架，用于黏附血小板、红细胞（RBC）和血小板黏附分子，例如纤维蛋白原、血管性血友病因子（VWF）和纤连蛋白。同时，NETs 的许多组成部分均可主动触发血小板活化和血液凝固，如组蛋白H3和H4对内皮细胞和上皮细胞具有高度的细胞毒性，同时它们也可以触发血小板聚集。而NE 和组织蛋白酶G 主要通过组织因子途径抑制剂（TFPI）的蛋白水解作用增强组织因子和XII 驱动的凝血。此外，NETs也可直接结合XII因子，并与血小板共同激活XII因子［33］。HE等［13］研究表明，NETs促进了IBD 患者的促凝活性，同时会加重血栓栓塞事件的发生。其中，TNF-α 在IBD 患者外周血中增加，从而引起NETs 释放，而以上过程主要与血小板-中性粒细胞相互聚集及宿主细胞与微生物相互作用相关。NETs 诱导产生的ANCAs 可引起磷脂酰丝氨酸（phosphatidylserine，PS）外翻，并为凝血因子FXa和凝血酶原酶复合物提供结合位点，进一步促进凝血酶和纤维蛋白生成。而凝血酶和FXa除了是凝血过程的被动介体外，还通过PAR 信号参与IBD 患者和小鼠模型中炎症的恶化和延长［34］。因此作者指出，NETs、磷脂酰丝氨酸及其诱导的凝血酶和FXa在IBD中提供了桥接免疫、炎症和血栓形成的联系。此外，NETs 参与血栓形成，通常是由配体结合中性粒细胞Toll样受体2（TLR2）和TLR4或IgG复合物的受体［35］。此外，体外研究发现，TLR2和TLR4拮抗剂能够降低PS+血小板的百分比及PS+的血小板微粒含量，同时，TLR4拮抗剂也能降低PS 在人脐静脉内皮细 胞（human umbilical vein endothelial cells，HUCECs）的表达［27］。因此，NETs 可能通过影响机体凝血功能在IBD的发生发展过程中起重要作用。

3 NETs与IBD治疗的关系

各种靶向NETs 的治疗药物已在临床中得到运用，如：囊性纤维化、痛风和SLE，预计在IBD 中也可能发挥作用［8，36］。目前，IBD 的常规治疗（包括氨基水杨酸制剂、激素等）虽有一定疗效，但仍存在部分患者对标准剂量激素反应差，或存在长期激素依赖抵抗情况；而针对部分激素治疗效果较差的中重度IBD 患者而言，以抗TNF-α 为代表的生物制剂极大改善了IBD 患者预后生存［37］。有研究指出，TNF-α能诱导UC 患者中性粒细胞产生NETs，而英夫利西单抗（IFX）通过阻断TNF-α 可显著降低UC 患者结肠组织中PAD4 和NETs 表达，为临床上抗TNF-α 治疗难治性IBD 提供了一定依据［25］。此外，动物实验显示，DSS诱导的UC小鼠肠道的拟杆菌和梭状芽孢杆菌明显增加，给予IBD 小鼠模型抗生素或将小鼠重置于无菌环境中都能显著缓解病情，从而证明肠道菌群在UC 发病中起到一定的作用［38］。VONG等［39］提到，CD患者的结肠组织中能经常分离到黏附侵袭性大肠埃希菌（adherent-invasiveEscherichia coli，AIEC），在使用抗生素的基础上，该细菌能增加实验性小鼠NETs 及ROS 的产生。同样，Afa/Dr 弥散黏附大肠杆菌（diffusely adheringEscherichia coli，DAEC）菌株C1845 诱导NETs 杀死细菌并损伤人肠上皮样细胞［29］。同时，有研究指出作为一种益生菌——鼠李糖乳杆菌能够抑制ROS 及NETs 的产生，该现象在体外实验小鼠骨髓中性粒细胞及人早幼粒细胞系d.HL-60 中得到验证［40］。基于以上研究，益生菌可能通过NETs 调节黏膜免疫反应，改善肠道菌群比例失调，修复损伤肠道黏膜，从而广泛用于IBD的辅助治疗。此外，由于NETs产生过程的复杂性及组成成分的多样性，多种物质可直接或间接地作用于NETs，可能成为治疗IBD 的前体物质，如作用于cf-DNA 的DNase 1、PAD4选择性抑制剂链黑菌素、ROS 清除剂N-乙酰半胱氨酸、MPO 的抑制剂PF1355、内源性NETosis 的抑制剂前列腺素E2（PGE2）等［8，25，27，36］。因此，NETs 靶向治疗将为IBD提供更多的治疗选择。

4 结语

自发现NETs 的10 余年来，有关NETs 的研究成为多种疾病的研究热点。由于NETs 自身组成成分中含有自身免疫性抗原物质，因此NETs 也与自身免疫性/炎症性疾病的发生发展密切相关。而炎症性肠病属于肠道自身炎症性疾病，研究结果发现NETs 可能通过放大炎症反应，加剧组织损伤、促进高凝状态等过程在IBD 中发挥重要作用，NETs 相关分子很可能成为IBD 治疗干预的靶标。然而，NETs在IBD 中具体的作用机制及NETs 与UC 和CD 之间的关系是否存在一定的差异尚不明确，因此，今后需要开展更多高质量的体外及体内研究，以期为IBD 的治疗方案和特异性靶点药物的开发提供新的思路。