闫海冰 张慧芳 冯 帆 于兆友 杨秀清

(山西农业大学林学院 太谷 030801)

土壤盐碱化已成为全球性的资源和环境问题，全球约有 9.5亿hm2的盐碱土。中国的盐碱土面积可达0.36亿hm2(潘雄波等，2016)，而这些土地已成为农林业发展的障碍用地，并严重影响我国的生态环境建设。研究植物的耐盐碱机制，评价并筛选耐盐碱植物进行盐碱地的生物改良，是实现盐碱地提质增效利用并实现盐碱地长效生态修复的重要途径(刘雨欣，2018)。

白刺属(Nitraria)是蒺藜科(Zygophyllaceae)的多分枝生态抗逆兼果肉经济型灌木，主要分布于我国新疆、青海、宁夏、甘肃以及内蒙古等地区的沙漠及盐碱地上，表现出较强的耐盐耐旱能力(杨秀艳等，2017)。目前，关于白刺耐盐机制及其评价研究大多集中于其生长特征、渗透调节系统、活性氧代谢以及光合特性等生理生化方面(李焕勇等，2019；杨秀艳等，2017；左凤月，2013；王文等，2012；武香等，2012；闫永庆等，2010)。基于蛋白组学方法可研究盐胁迫下白刺蛋白表达的变化(Chengetal.，2015)，然而基因和蛋白质在mRNA水平上增加或减少并不直接影响相应蛋白表达的变化(Gygietal.，1999)；即使蛋白质已经被翻译，也不可能总是能提高酶活性(Sumneretal.，2003)。代谢组学方法克服了蛋白组学方法无法完全描述生化合成的细胞内代谢系统的不足，可通过代谢物的上下调变化以及代谢物实际参与的代谢通路(途径)来真实地表征植物耐盐反应和发生过程(蒋丹，2019；Saito et al.，2010)。因此，基于代谢组学方法研究盐胁迫下白刺的耐盐反应，可以全面揭示白刺细胞内代谢状态，获得有关白刺代谢物的综合信息，对于深入了解白刺对盐胁迫响应的代谢途径及过程非常重要(Nietal.，2015；冯帆等，2019)。

本文以唐古特白刺(N.tangutorum)和西伯利亚白刺(N.sibirica)叶片为研究对象，采用GC-TOF-MS代谢组学方法，研究盐胁迫下2种白刺叶片代谢物及其代谢通路的变化，以揭示这2种白刺对盐胁迫的代谢响应机制，为有效提高白刺对盐碱地的持续生物改良及适应性研究提供基础理论依据。

1 材料与方法

1.1 种子采集及实生苗培养

西伯利亚白刺种子和唐古特白刺种子均为取自内蒙古巴彦淖尔市磴口县(海拔1 036 m, 40°32′N, 106°28′E)白刺产地的野生种。分别挑选大小一致、颗粒饱满的2种白刺的种子先后于50 ℃恒温水浴锅浸泡24 h，0.5‰KMnO4溶液避光浸泡2 h，用蒸馏水清洗干净备用。

采用纯沙进行幼苗培养。将0.5% KMnO4溶液杀菌后的纯沙置于16 cm×14 cm营养钵中，每钵播白刺种子50粒，每品种12钵，共24钵，种植深度约4 cm，置于温室内进行培养。培养条件设为平均温度26 ℃，光照时长14 h，光照强度1 200 Lux，每3天每钵浇灌蒸馏水100 mL，保持纯沙含水量60%。

1.2 盐胁迫处理及取样

待幼苗生长至25 cm左右且叶量充足时进行盐胁迫处理。此时唐古特白刺每钵平均出苗35株，西伯利亚白刺每钵平均出苗28株。分别将每种白刺的12钵幼苗随机分为2组，每组6钵，并统一留苗20株，试验组每3天浇灌300 mmol·L-1NaCl溶液100 mL，对照组浇灌等量的蒸馏水，为防止盐分流失，营养钵底部垫有塑料托盘，浇灌后渗出的溶液要重新倒回营养钵内，并定时记录2种白刺的生长状况。

胁迫后第7天试验组有植株顶端嫩叶边缘出现微黄，此时随机剪取各钵幼苗中上部第2节完好叶片100 mg，每组6次。所取样品用锡箔纸包好并编号，液氮浸泡7 min后迅速取出，置于-80 ℃冰箱备用。

1.3 代谢物提取及检测

取样本25 mg于2 mL EP管中，加入提取液300 μL、核糖醇5 μL，涡旋30 s后加入瓷珠，45 Hz研磨仪处理4 min，超声5 min(冰水浴)，4 ℃、12 000 r·min-1离心15 min，之后取200 μL上清液于1.5 mL EP管中，每个样本各取50 μL混合成QC样本，真空浓缩器中干燥后加入甲氧胺盐试剂30 μL，混匀，80 ℃孵育30 min，再加入40 μL BSTFA，混匀，70 ℃孵育1.5 h，冷却至室温，加入5 μL FAMEs，备测。

使用配有Agilent DB-5MS毛细管柱的Agilent 7890气相色谱-飞行时间质谱联用仪(30 m×250 μm×0.25 μm, J&W Scientific, Folsom, CA, USA)进行GC-TOF/MS检测。

1.4 数据处理

采用ChromaTOF软件(V 4.3x，LECO)对质谱数据进行峰提取、基线矫正、解卷积、峰积分、峰对齐等分析(冯帆等，2019)；使用LECO-Fiehn Rtx5数据库分析质谱匹配及保留时间指数匹配进行物质定性，利用内标对代谢物数据进行归一化处理。通过SIMCA软件(V14.1, Sartorius Stedim Data Analytics AB, Umea, Sweden)对归一化数据进行对数转换、中心化格式化处理、主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法(OPLS-DA)分析，依据OPLS-DA模型第一主成分的VIP值>1.0、t检验的P<0.05来筛选差异代谢物(李焕勇，2018)。对差异代谢物进行层次聚类分析，并利用KEGG、PubChem等相关数据库挖掘差异代谢物参与的通路，最后通过富集分析和拓扑分析筛选与代谢物差异相关性最高的关键通路。

2 结果与分析

2.1 代谢物的PCA和OPLS-DA分析

通过对2个种24个白刺样品的总离子流色谱图(TIC)进行扫描和重叠(图1)，发现TIC出峰保留时间和峰面积都重叠较好。

利用SIMCA软件对图1中的代谢谱数据进行PCA和OPLS-DA分析，发现盐胁迫前后，唐古特白刺代谢物在第二主成分(PC2)上区分显著，而西伯利亚白刺代谢物在第一主成分(PC1)上区分显著(图2)，此外，2种白刺在2种处理下的数据点在第一主成分的预测主成分得分上区分显著(图3)，即2种白刺在盐胁迫前后均有差异代谢物存在，且西伯利亚白刺代谢物差异更为显著。由2种白刺的OPLS-DA置换检验图(图3)可知原模型具有良好的稳健性。

图1 所有QC样本的TIC重叠

2.2 差异代谢物的筛选和分析

依据OPLS-DA模型第一主成分的VIP值大于1.0、t检验的P值小于0.05筛选组间的差异代谢物(表1)，并对这些差异代谢物进行整理分类(图4)。300 mmol·L-1NaCl胁迫处理前后唐古特白刺共筛选出差异代谢物11种，其中3种显著下调，8种显著上调，包括1种脂肪酸、5种有机酸、1种醇以及1种碱基衍生物(上调浓度介于1.32～2.68倍之间)；而西伯利亚白刺筛选出差异代谢物108种，其中2种显著下调，106种显著上调，包括51种氨基酸、22种糖、11种脂肪酸、8种有机酸、7种醇、5种生物碱以及2种维生素(上调浓度介于0.54～14.45倍之间)。以上结果表明，相比唐古特白刺，西伯利亚白刺有更多的代谢物参与盐胁迫响应。

图4 盐胁迫后2种白刺叶片中差异代谢物的分类

2.3 差异代谢物的KEGG注释及代谢通路分析

通过KEGG注释将唐古特白刺的差异代谢物富集到了6条代谢通路中，而将西比利亚白刺的差异代谢物富集到了46条代谢通路中(表2)。对注释得到的代谢通路进行富集分析和拓扑分析，进一步筛选到与唐古特白刺代谢物差异相关性最高的关键路径为硫代谢、二羧酸循环及TCA循环(图5)，说明唐古特白刺主要通过加强这3条代谢通路来响应盐胁迫。其中硫代谢最为显著，参与此代谢通路的差异代谢物为O-琥珀酰-L-高丝氨酸，其含量显著上调，为未胁迫时的2.68倍。筛选到与西伯利亚白刺代谢物差异相关性最高的关键路径为缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成、C5支链二元酸代谢、泛酸和CoA生物合成、苯丙氨酸代谢、硫代谢、络氨酸代谢，属于氨基酸生物合成的代谢通路数量多达13条，即氨基酸代谢在西伯利亚白刺响应盐胁迫过程中发挥主要作用(图5)。其中，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成途径差异性最为显著，参与此代谢通路的差异代谢物分别为柠檬酸、L-亮氨酸、3-苹果酸异丙酯、L-缬氨酸、L-异亮氨酸以及丙酮酸，其含量均显著上调，为未胁迫时的1.21～3.12倍。

表2 盐胁迫后2种白刺差异代谢物映射的KEGG通路

图5 唐古特白刺(上)和西伯利亚白刺(下)的代谢通路分析

3 讨论

植物对逆境胁迫的响应是一个复杂的过程，其中最重要的是代谢的改变，即植物通过调节代谢网络以诱导产生一系列特殊代谢物，从而达到对生物、非生物胁迫的防御作用(郭凤丹等，2017)。

3.1 盐胁迫下2种白刺代谢物的变化

逆境胁迫时，植物通过启动一系列细胞、分子以及生理生化水平上的调节，以维持细胞代谢平衡(倪建伟等，2014)。代谢物作为细胞调控过程的终产物，是联系基因型和表型的纽带，其种类和数量的变化被视为植物对基因或环境变化的最终响应(Zhangetal., 2019；Fernieetal., 2008)。本研究中，盐胁迫下西伯利亚白刺鉴定出差异代谢物108种，其中106种显著上调，而唐古特白刺仅鉴定出11种，其中8种显著上调，即相比唐古特白刺，西伯利亚白刺存在更多的代谢物质参与盐胁迫调控。就盐胁迫后2种白刺的代谢差异物相比，代谢物种类差距较大的主要集中在氨基酸、糖以及脂肪酸，而生物碱、碱基衍生物以及维生素等代谢物的种类均比较少，且含量上调、下调不显著。

盐胁迫后西伯利亚白刺叶片中51种氨基酸含量显著上调，而唐古特白刺叶片中1种上调。氨基酸作为蛋白质的组成单位，是能量代谢物质，也是许多生物体内重要含氮化合物的前体(徐春英，2008)，其在植物体内的积累可作为一种耐盐指示物进而反映植物的耐盐性(燕辉等，2012)。同时，在植物响应非生物胁迫中，氨基酸通过参与植物生理代谢，调节相关基因表达和关键酶的活性以提高植物对逆境的抗性(邢芳芳等，2018；杨冬爽，2017)。因此，与唐古特白刺相比，西伯利亚白刺在响应盐胁迫时氨基酸类代谢物的变化更为显著，可为其抵御盐胁迫提供更多的物质和能量(段二龙等，2019)。

可溶性糖参与植物对逆境胁迫的响应(武香等，2012)。与盐敏感玉米杂交种(Logo)相比，盐胁迫下耐盐玉米(Zeamays)杂交种(SR08)通过代谢物葡萄糖、果糖和蔗糖的积累以提高其耐盐适应性(Richteretal.，2015)。本研究中，盐胁迫后西伯利亚白刺叶片中22种糖类代谢物显著上调，这些糖类代谢物在应答盐胁迫时既可以作为渗透调节物质减缓渗透胁迫，也可作为合成有机溶质的碳架和能量来源，为白刺抵抗盐胁迫提供重要能量(冯帆等，2019)，同时，糖降解过程中的许多代谢产物也是合成氨基酸的前体物质，如丝氨酸、丙氨酸、缬氨酸等。但是，盐胁迫后唐古特白刺叶片中唯一的糖类代谢物乳糖显著下调，其他可溶性糖的含量无明显变化，这表明，可溶性糖可能不参与唐古特白刺对盐胁迫的应答。

脂肪酸是生物体贮藏能量的主要来源以及细胞膜脂的重要组成成分(冯帆等，2019)，参与植物对多种生物、非生物胁迫的响应，通过调控植物体基础免疫、效应子诱导抗性及系统抗性等多种防御途径以提高植物对逆境胁迫的抗性(刘文献等，2014)。生物膜是逆境胁迫中受损伤的主要位点，植物体通过脂肪酸脱饱和维持膜的流动性以适应逆境(杨冬爽，2017；年洪娟等，2012)。Yang等(2017)研究发现，响应盐胁迫时，耐盐野生大豆(Glycinesoja)的脂肪酸代谢物含量明显高于普通野生大豆。本研究中，盐胁迫后西伯利亚白刺叶片中显著上调的脂肪酸代谢物共11种，其中，亚麻酸还是植物合成抗逆信号分茉莉酸的前体物质(Xue，2006)；而唐古特白刺叶片中脂肪酸代谢物仅亚油酸，说明与唐古特白刺相比较，脂肪酸在西伯利亚白刺的耐盐调控中发挥着更重要的作用。

3.2 盐胁迫下2种白刺代谢通路的变化

本研究中，盐胁迫后西伯利亚白刺的差异代谢物主要富集到氨基酸代谢(相关通路多达13条)，且代谢途径的差异性以缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的生物合成最显著，表明西伯利亚白刺可能通过氨基酸代谢迅速合成亲和性渗透物质以调节细胞的渗透势，维持细胞正常的生长和发育(徐春英，2008)。此外，氨基酸在细胞内可经生物合成形成蛋白质，也可进行分解代谢产生ATP，或转化为糖和脂肪，为抵御盐胁迫提供能量。盐胁迫后唐古特白刺并未发现有差异代谢物被富集到氨基酸代谢中，即唐古特白刺在响应盐胁迫时氨基酸代谢并不显著。

植物可通过硫代谢的加强以提高其对逆境胁迫的适应性(包雨卓，2017)。在活性氧清除系统中作用最突出的含硫化合物是谷胱甘肽(GSH)，GSH是硫代谢的重要产物，也是硫代谢的一种重要的信号物质，GSH的增多有助于维持植物正常的碳和氮代谢(高吉霞，2010)。在唐古特白刺中，与盐胁迫代谢物差异相关性最高的关键路径为硫代谢，且以参与该途径的O-琥珀酰-L-高丝氨酸含量上调最为显著；同时，西伯利亚白刺硫代谢途径差异性也较显著，参与该途径的硫酸盐和L-半胱氨酸含量也显著上调，说明硫代谢可能是2种白刺用于抵抗盐胁迫的有效途径之一。

TCA循环是糖、脂肪和氨基酸三大营养物质的最终代谢通路和代谢联系枢纽，该循环代谢的中间产物又可作为许多生物合成途径的起点(李明达等，2010)，在植物对逆境胁迫的响应中扮演着重要角色。本研究中，盐胁迫后唐古特白刺显著上调的代谢物柠檬酸参与TCA循环，胁迫后西伯利亚白刺叶片中参与TCA循环的柠檬酸和丙酮酸也显著上调。柠檬酸可以直接参与机体能量、结构和酶促反应，在TCA循环中可被完全氧化生成ATP，具有高能量利用率(崔媛等，2019)。丙酮酸是糖酵解途径的最终产物，可以在细胞浆中还原成乳酸供能，还可通过乙酰CoA和TCA循环完成葡萄糖的有氧氧化供能过程，实现植物体内糖、脂肪和氨基酸间的相互转化(路文静，2011)。柠檬酸和丙酮酸的显著上调表明盐胁迫后2种白刺的TCA循环有所增强，即TCA循环在2种白刺抵御盐胁迫调控中发挥了重要的作用。

植物响应盐胁迫时，新陈代谢较为复杂，涉及氨基酸类、糖类及有机酸类等代谢物及相关代谢通路的变化(Chandnaetal.，2013)，代谢物的含量反映了与之相关基因的表达量，也表明盐胁迫对这些代谢途径相关基因的表达具有调控作用(赵佳利等，2019)。Yang等(2017)研究表明，耐盐野生大豆主要通过氨基酸代谢与有机酸代谢来响应盐胁迫，而普通野生大豆主要通过TCA循环来响应盐胁迫。本研究中2种白刺在盐胁迫下代谢物与代谢通路均发生变化，且表现出不同的代谢响应策略，与唐古特白刺相比，西伯利亚白刺在响应盐胁迫时参与的代谢物种类更多，途经更广，代谢响应更显著。本研究前期试验(冯鑫炜等，2015)表明，300 mmol·L-1NaCl胁迫时唐古特白刺平均生物量达2.97 g，根冠比为0.21，叶片电解质渗透率25.27%，MDA含量为8.63 μmol·L-1FW，SOD活性为357.80 U·g-1；西伯利亚白刺平均生物量达5.39 g，根冠比为0.33，叶片电解质渗透率20.08%，MDA含量为6.58 μmol·L-1FW，SOD活性为408.47 U·g-1。西伯利亚白刺从生长和生理方面表现出了优于唐古特白刺的耐盐性，这与左凤月(2013)、武香(2012)等的研究结果相吻合。本研究中2种白刺对盐胁迫的代谢响应与生长、生理响应的一致性进一步验证了西伯利亚白刺具有比唐古特白刺较好的耐盐性。

4 结论

唐古特白刺与西伯利亚白刺对盐胁迫有着不同的代谢响应机制。唐古特白刺通过以有机酸为主的11种代谢物参与盐胁迫响应，并通过加强以硫代谢为主的6条代谢通路来应答盐胁迫。西伯利亚白刺通过以氨基酸、糖、脂肪酸为主的108种代谢物参与盐胁迫响应，并通过加强以氨基酸代谢为主的46条代谢通路来应答盐胁迫。西伯利亚白刺参与盐胁迫调控的代谢物较唐古特白刺种类更多，代谢途径更广，对盐胁迫的代谢响应更显著。